"МУК 4.1.2931-11. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств диметоморфа в воде, семенах и масле рапса методом капиллярной газожидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 12.07.2011)

1. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 02.06.2011 N 1).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 12 июля 2011 г.

3. Введены в действие с момента утверждения.

4. Введены впервые.

Свидетельство о метрологической аттестации N 0074.28.01.11 от 02.03.2011.

Настоящие методические указания устанавливают метод капиллярной газожидкостной хроматографии для определения массовых концентраций диметоморфа в воде, семенах и масле рапса в диапазоне 0,001 - 0,01 мг/куб. дм и 0,01 - 0,1 мг/кг соответственно.

(E,Z)-4-[3-(4-(хлорфенил)-3-(3,4-диметоксифенил)акрилоил]морфолин (IUPAC).

Структурная формула (не приводится).

Область применения препарата: диметоморф - системный фунгицид для борьбы с заболеваниями, вызываемыми оомицетами, особенно с возбудителями милдью винограда и фитофтороза картофеля и томатов.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20) приведены в табл. 2.

Метод основан на определении диметоморфа с использованием капиллярной газожидкостной хроматографии (ГЖХ) с электронозахватным детектором (ЭЗД) после извлечения вещества из анализируемых образцов воды - дихлорметаном, семян и масла рапса - ацетонитрилом, очистки экстрактов перераспределением в системе несмешивающихся растворителей и на колонке с флорисилом.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Допускается использование реактивов иных производителей с более высокой квалификацией, не требующих выполнения п. 7.1 (очистка растворителей).

Допускается применение другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

4.3. При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 МПа (150 кгс/кв. см), необходимо соблюдать "Правила устройства и безопасной эксплуатации стационарных компрессорных установок, воздухопроводов и газопроводов под давлением", ПБ-03-576-03. Запрещается открывать вентиль баллона, не установив на нем понижающий редуктор.

К выполнению измерений допускают специалиста, имеющего квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на газовом хроматографе, освоившего данную методику и подтвердившего экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией "лаборант", имеющего опыт работы в химической лаборатории.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление градуировочных растворов, растворов внесения, установление градуировочной характеристики, приготовление смесей растворителей для очистки экстрактов на колонке, подготовка колонки с флорисилом, проверка хроматографического поведения диметоморфа на ней.

7.1.1. Ацетонитрил

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора (на 1 куб. дм ацетонитрила 20 г пентоксида фосфора) не менее 1 ч, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия (на 1 куб. дм ацетонитрила 10 г карбоната калия).

7.1.2. н-Гексан

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты, до тех пор, пока она не перестанет окрашиваться в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над прокаленным карбонатом калия.

7.1.3. Дихлорметан и этилацетат

7.1.3.1. Приготовление раствора натрия углекислого с массовой долей 5%. Навеску (25 +/- 0,1) г натрия углекислого помещают в мерную колбу вместимостью 500 куб. см, растворяют в бидистиллированной воде, доводят водой до метки, перемешивают.

7.1.3.2. Очистка растворителей. Каждый растворитель промывают последовательно 5%-м водным раствором натрия углекислого, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над прокаленным карбонатом калия и перегоняют или подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретических тарелок не менее 30.

7.2.1. Исходный раствор диметоморфа для градуировки (концентрация 200 мкг/куб. см)

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 0,01 г диметоморфа, растворяют в 50 - 70 куб. см этилацетата доводят до метки этим же растворителем, тщательно перемешивают. Раствор хранится в холодильнике в течение 3 месяцев.

7.2.2. Раствор N 1 диметоморфа для градуировки (концентрация 20 мкг/куб. см)

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 10,0 куб. см исходного раствора диметоморфа для градуировки с концентрацией 200 мкг/куб. см (п. 7.2.1), доводят до метки гексаном, тщательно перемешивают.

Раствор хранится в холодильнике в течение месяца.

7.2.3. Рабочие растворы N 2 - 5 диметоморфа для градуировки (концентрация 0,2 - 2,0 мкг/куб. см)

В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают по 1,0, 2,5, 5,0 и 10 куб. см раствора N 1 диметоморфа с концентрацией 20 мкг/куб. см (п. 7.2.2), доводят до метки гексаном, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 2 - 5 с концентрацией диметоморфа 0,2, 0,5, 1,0 и 2,0 мкг/куб. см соответственно.

Растворы хранятся в холодильнике не более 14 дней.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость суммы площадей хроматографических пиков E- и Z-изомеров (мВ x с) от концентрации диметоморфа в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки N 2 - 5.

В инжектор хроматографа вводят 1 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.4. Осуществляют не менее 3 параллельных измерений.

Градуировочную характеристику проверяют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов. Если значение суммы площадей отличается более чем на 12% от данных, заложенных в градуировочную характеристику, ее строят заново, используя свежеприготовленные рабочие растворы для градуировки.

7.4.1. Смесь гексан-этилацетат (объемное соотношение 9:1). В мерную колбу вместимостью 250 куб. см помещают 225 куб. см гексана и 25 куб. см этилацетата, перемешивают.

7.4.2. Смесь гексан-этилацетат (объемное соотношение 7:3). В мерную колбу вместимостью 250 куб. см помещают 175 куб. см гексана и 75 куб. см этилацетата, перемешивают.

7.4.3. Смесь гексан-этилацетат (объемное соотношение 1:1). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 50 куб. см гексана и 50 куб. см этилацетата, перемешивают.

7.5.1. Исходный раствор диметоморфа для внесения (концентрация 100 мкг/куб. см). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 0,01 г диметоморфа, растворяют в 50 - 70 куб. см ацетонитрила, доводят до метки этим же растворителем, тщательно перемешивают. Раствор хранится в холодильнике в течение 3 месяцев.

7.5.2. Раствор N 1 диметоморфа для внесения (концентрация 10 мкг/куб. см). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 10,0 куб. см исходного раствора диметоморфа для внесения с концентрацией 100 мкг/куб. см (п. 7.2.2), доводят до метки ацетонитрилом, тщательно перемешивают.

Раствор хранится в холодильнике в течение месяца.

Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см, внутренним диаметром 10 - 12 мм уплотняют тампоном из стекловаты, выливают в колонку (при открытом кране) суспензию 4 г флорисила в 30 куб. см гексана. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента, на который помещают слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку последовательно промывают смесями гексан-этилацетат в объемном соотношении 7:3, затем - 9:1, порциями по 30 куб. см, скорость прохождения растворителя 1 - 2 кап./с. Колонка готова к работе.

В круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 0,5 куб. см раствора N 1 диметоморфа с концентрацией 10 мкг/куб. см (п. 7.5.2), упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре водяной бани не выше 35 °C. Сухой остаток растворяют в 3 куб. см смеси гексан-этилацетат (9:1, по объему), помещая на ультразвуковую баню на 40 - 60 с, и наносят на колонку, подготовленную по п. 7.6. Колбу обмывают дважды этой же смесью растворителей, порциями по 3 куб. см, которые также наносят на колонку. Скорость прохождения растворителя через колонку - 1 - 2 кап./с. Промывают колонку 30 куб. см смеси гексан-этилацетат в объемном соотношении 9:1, затем 100 куб. см смеси гексан-этилацетат в объемном соотношении 7:3, элюат отбрасывают.

Затем колонку промывают 60 куб. см смеси гексан-этилацетат (1:1, по объему) со скоростью 1 - 2 кап./с. Фракционно (по 10 куб. см) отбирают элюат, упаривают, остатки растворяют в 2 куб. см смеси гексан-этилацетат (1:1, по объему), анализируют содержание диметоморфа по п. 9.4.

Фракции, содержащие диметоморф, объединяют и вновь анализируют.

Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с колонки и необходимый для очистки объем элюента.

Примечание: Проверку хроматографического поведения диметоморфа следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии сорбентов и растворителей.

Отбор проб производится в соответствии с правилами, определенными ГОСТами: вода - ГОСТ Р 51592-2000 "Вода. Общие требования к отбору проб", рапс - ГОСТ 10852-6 "Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб", ГОСТ 10583-76 "Рапс. Требования при заготовках и поставках", масло - ГОСТ 52062-2003 "Масло растительное. Правила приемки и методы отбора проб", ГОСТ Р 53457-2009 "Масло рапсовое. Технические условия", "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79).

Отобранные пробы воды хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике не более недели. Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре -18 °C. Перед анализом образцы воды фильтруют через неплотный бумажный фильтр.

Семена подсушивают в темноте до постоянного веса и хранят в тканевых мешочках в сухом, защищенном от света месте при комнатной температуре не более 6 месяцев. Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре -18 °C. Перед анализом образцы семян измельчают.

Пробы масла (помещенные в стеклянные флаконы) хранят в холодильнике в темноте.

Образец отфильтрованной воды объемом 400 куб. см помещают в делительную воронку объемом 1000 куб. см, добавляют 75 куб. см дихлорметана, делительную воронку встряхивают в течение двух минут. После полного разделения слоев нижний органический слой фильтруют через слой безводного сульфата натрия, помещенный на бумажном фильтре в конусной воронке, в круглодонную колбу на 250 куб. см. Повторяют экстракцию дважды, используя по 50 куб. см дихлорметана.

Объединенную органическую фракцию упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 35 °C. Сухой остаток подвергают дополнительной очистке по п. 9.1.2.

Остаток, полученный по п. 9.1.2, находящийся в круглодонной колбе, растворяют в 0,5 куб. см этилацетата, помещают на ультразвуковую баню на 30 с, затем добавляют 4,5 куб. см гексана, выдерживая еще 1 мин. на ультразвуковой бане. Раствор наносят на колонку, подготовленную по п. 7.6. Колбу обмывают дважды смесью гексан-этилацетат (9:1, по объему) порциями по 3 куб. см, которые также наносят на колонку. Скорость прохождения растворителя через колонку - 1 - 2 кап./с. Промывают колонку 50 куб. см гексана, 30 куб. см смеси гексан-этилацетат в объемном соотношении 9:1, затем 100 куб. см смеси гексан-этилацетат в объемном соотношении 7:3, элюат отбрасывают.

Диметоморф элюируют с колонки 60 куб. см смеси гексан-этилацетат в объемном соотношении 1:1 со скоростью 1 - 2 кап./с, собирая элюат в круглодонную колбу вместимостью 150 куб. см, раствор упаривают досуха при температуре не выше 35 °C, остаток растворяют в 2 куб. см (пробы воды) и 1 куб. см (пробы семян и масла рапса) смеси гексан-этилацетат (1:1, по объему) и анализируют на содержание диметоморфа по п. 9.4.

Пробу семян рапса массой 20 г помещают в коническую колбу на 250 - 300 куб. см, добавляют 50 куб. см ацетонитрила и помещают на аппарат для встряхивания на 30 мин.

Пробам дают отстояться, затем надосадочную жидкость фильтруют на воронке Бюхнера с помощью разряжения, создаваемого водоструйным насосом, через двойной фильтр "красная лента". В коническую колбу с пробой вносят новую порцию ацетонитрила объемом 30 куб. см и повторно экстрагируют на аппарате для встряхивания в течение 20 мин., затем раствор фильтруют на воронке Бюхнера. Фильтр промывают ацетонитрилом порцией 20 куб. см.

Объединенный отфильтрованный экстракт переносят в делительную воронку на 250 куб. см и подвергают очистке по п. 9.2.2.

К ацетонитрильному экстракту, полученному по п. 9.2.1 и помещенному в делительную воронку на 250 куб. см, добавляют 30 куб. см гексана, интенсивно встряхивают в течение 2 - 3 мин. После полного разделения слоев, верхний гексановый слой отбрасывают. Ацетонитрильный экстракт возвращают в делительную воронку и повторяют операцию очистки с новой порцией гексана объемом 30 куб. см.

Затем ацетонитрильный раствор переносят в колбу для упаривания на 150 куб. см, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 35 °C. Сухой остаток подвергают дополнительной очистке на колонке с флорисилом по п. 9.1.2.

Образец масла массой 20 г помещают в коническую колбу вместимостью 200 - 250 куб. см, растворяют в 100 куб. см гексана, переносят в делительную воронку вместимостью 500 куб. см, добавляют 50 куб. см ацетонитрила. Воронку интенсивно встряхивают 2 мин. После полного разделения фаз нижний слой осторожно декантируют через бумажный фильтр, помещенный в конусную воронку, в химический стакан вместимостью 250 куб. см. Экстракцию повторяют новой порцией ацетонитрила объемом 30 куб. см.

Растворы объединяют, переносят в делительную воронку на 250 куб. см и подвергают очистке в системе несмешивающихся растворителей и на колонке с флорисилом по п. п. 9.2.2 и 9.1.2.

Газовый хроматограф, снабженный электронозахватным детектором.

Колонка капиллярная DB-1701 длиной 30 м, внутренним диаметром 0,32 мм, толщина пленки сорбента 0,25 мкм.

Температура:

детектора 320 °C;

испарителя 300 °C.

Температура термостата колонки программированная. Начальная температура - 130 °C, выдержка 1 мин., нагрев колонки со скоростью 25 градусов в минуту до температуры 280 °C, выдержка 16 мин.

Скорость газа 1 (азот): давление 80 кПа, 33,12 см/с, поток 1,625 куб. см/мин.

Газ 2 (азот): деление потока 1:3; сброс 6,9 куб. см/мин.

Хроматографируемый объем: 1 куб. мм.

Ориентировочное время выхода диметоморфа:

E-изомер ~ 18 мин.;

Z-изомер ~ 19 мин.

Линейный диапазон детектирования: 0,2 - 2,0 нг.

Образцы, дающие пики большие, чем градуировочный раствор с концентрацией 2,0 мкг/куб. см, разбавляют смесью гексан-этилацетат (1:1, по объему, не более чем в 50 раз.

Содержание диметоморфа в пробе (X, мг/куб. дм, мг/кг) рассчитывают по формуле:

где:

C - концентрация диметоморфа, найденная по градуировочной характеристике в соответствии с величиной суммы площадей хроматографических пиков Z- и E-изомеров, мкг/куб. см;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;

m - масса (объем) анализируемого образца, г (куб. см).

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

где дельта - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание диметоморфа в пробе воды - менее 0,001 мг/куб. дм, семян и масла рапса - 0,01 мг/кг" <*>.

--------------------------------

<*> - 0,001 мг/куб. дм, 0,01 мг/кг - предел обнаружения диметоморфа в пробах воды, семян и масла рапса, соответственно.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-(1-6)-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предела воспроизводимости (R):

ФГУН "Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана" Роспотребнадзора.