"МУК 4.1.2784-10. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств дифеноконазола в ягодах и соке винограда методом капиллярной газожидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 24.11.2010)

1. Разработаны Всероссийским научно-исследовательским институтом фитопатологии.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 14.10.2010 N 2).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 24 ноября 2010 г.

4. Введены в действие с момента утверждения.

5. Введены впервые.

Свидетельство об аттестации методики N 0036.16.07.10 от 19.07.2010.

Настоящий документ устанавливает процедуру измерений массовой доли дифеноконазола в ягодах винограда в диапазоне 0,02 - 0,2 мг/кг, в виноградном соке в диапазоне 0,01 - 0,1 мг/кг методом капиллярной газожидкостной хроматографии.

Название вещества по ИСО: дифеноконазол.

Название вещества по ИЮПАК: 4-хлорфениловый эфир cis,trans-3-хлор-4-[4-метил-2-(1Н-1,2,4-триазол-1-илметил)-1,3-диоксолан-2-ил] фенила.

Структурная формула (не приводится).

В России установлены следующие гигиенические нормативы:

ДСД - 0,01 мг/кг массы тела человека; МДУ в яблоках, грушах, сахарной свекле - 0,1 мг/кг, в зерне хлебных злаков - не допускается в пределах чувствительности метода контроля.

Область применения препарата:

Дифеноконазол - системный фунгицид и протравитель семян. Обладает длительным защитным и лечебным действием против широкого круга растительных патогенов из классов аскомицетов, базидиомицетов, дейтеромицетов, включая возбудителей альтернариоза, септориоза, церкоспороза, парши, антракноза, ржавчины, мучнистой росы, а также некоторых патогенов, обитающих на семенах пшеницы, сахарной свеклы, картофеля, семечковых плодовых и овощных культур.

Применяется в России в качестве составного компонента комбинированных протравителей для предпосевной обработки семян сахарной свеклы, зерновых колосовых культур и рапса при норме расхода 45 - 60 г д.в./т семян, а также используется для обработки вегетирующих растений сахарной и столовой свеклы, картофеля, моркови и рапса, яблоневых и грушевых садов с нормой расхода до 100 г д.в./га.

При соблюдении всех регламентированных условий и проведении анализа в точном соответствии с данной методикой значение погрешности (и ее составляющих) результатов измерений не превышает значений, приведенных в табл. 1.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 2.

Метод основан на экстракции дифеноконазола из ягод ацетоном, из сока смесью гексан - диэтиловый эфир (4:1, по объему), очистке экстрактов, содержащих дифеноконазол, от коэкстрактивных компонентов перераспределением их в системе несмешивающихся растворителей, а также на колонке с силикагелем и концентрирующем патроне Диапак-диол, с последующим измерением содержания дифеноконазола в очищенных экстрактах методом капиллярной газожидкостной хроматографии (ГЖХ) при программировании температуры с электронозахватным детектором (ЭЗД) и обработкой хроматограмм методом абсолютной калибровки.

В предлагаемых условиях анализа метод специфичен.

Допускается применение других средств измерений, вспомогательных устройств, реактивов и материалов с техническими и метрологическими характеристиками не хуже приведенных в разделе 3.

4.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работы с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.007-76, ГОСТ 12.1.005-88.

4.2. При проведении анализов горючих и вредных веществ соблюдают требования противопожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и должны быть в наличии средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83.

4.3. При выполнении измерений с использованием хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцией по эксплуатации прибора.

4.4. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07.

К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются специалисты, имеющие высшее или специальное химическое образование, опыт работы в химической лаборатории, прошедшие обучение и владеющие техникой проведения анализа, освоившие метод анализа в процессе тренировки и уложившиеся в нормативы контроля при проведении процедуры контроля погрешности анализа.

6.1. При выполнении измерений соблюдают следующие условия.

Условия приготовления растворов и подготовки проб к анализу:

- температура воздуха (20 +/- 5) °С;

- атмосферное давление (84 - 106) кПа;

- относительная влажность воздуха не более 80%.

6.2. Условия хроматографического анализа:

Режим программирования температуры колонки:

начальная температура 200 °С (2 мин.), скорость подъема температуры до 275 °С (7 мин.) 20 °С/мин.;

от 275 °С до 290 °С (5 мин.), скорость подъема температуры 10 °С/мин.

Расход газов:

газа-носителя (азот) 2,5 куб. см/мин.;

поддувочного газа через детектор 25 куб. см/мин.

Деление потока: 1:1.

Время удерживания дифеноконазола: (8,5 +/- 0,2) мин.

Линейный диапазон детектирования: (0,02 - 0,25) нг.

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики, подготовка колонки с силикагелем и концентрирующих патронов Диапак-диол.

7.1.1. Очистка н-гексана

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до прекращения окрашивания последней в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над поташом.

7.1.2. Очистка ацетона

7.1.3. Очистка силикагеля

Силикагель I степени активности встряхивают с двойным объемом очищенного ацетона и затем фильтруют на воронке Бюхнера через бумажный фильтр. Силикагель на фильтре промывают 1,5 объемом ацетона, высушивают в вытяжном шкафу при комнатной температуре в течение 5 - 6 ч и затем активируют при температуре 130 °С в течение 5 ч.

Капиллярную кварцевую колонку ZB-1 (типа SE-30) устанавливают в термостат хроматографа и, не подсоединяя к детектору, кондиционируют при температуре 290 °С и скорости газа-носителя 2 куб. см/мин. в течение 8 - 10 часов.

Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 8 - 10 мм уплотняют тампоном из стекловаты, медленно выливают в колонку (при открытом кране) суспензию 3 г силикагеля I степени активности в 15 куб. см гексана. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку промывают 15 куб. см смеси гексан - ацетон (8:2, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в секунду, после чего она готова к работе.

Концентрирующий патрон Диапак-диол промывают последовательно с помощью медицинского шприца 10 куб. см смеси гексан - ацетон (1:1, по объему) и 6 куб. см смеси гексан - ацетон (9:1, по объему) со скоростью 5 куб. см/мин. Нельзя допускать высыхания поверхности патрона.

При отработке методики или поступлении новой партии силикагеля проводят определение объема элюента, необходимого для полного вымывания дифеноконазола из колонки с силикагелем.

В круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 0,2 куб. см градуировочного раствора дифеноконазола с массовой концентрацией 2 мкг/куб. см в смеси гексан - ацетон (8:2, по объему) (п. 7.6.2). Отдувают растворитель током теплого воздуха, остаток растворяют в 2 куб. см смеси гексан - ацетон (8:2, по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на колонку с силикагелем, подготовленную по п. 7.3. Промывают колонку 30 куб. см смеси гексан - ацетон (7:3, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в секунду, элюат отбрасывают. Затем через колонку пропускают 40 куб. см смеси гексан - ацетон (1:1, по объему), отбирая последовательно по 5 куб. см элюата. Каждую фракцию упаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 40 °С, сухие остатки растворяют в 1 куб. см смеси гексан - ацетон (8:2, по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., и затем хроматографируют в соответствии с п. 6.2.

По результатам обнаружения дифеноконазола в каждой из фракций определяют объем смеси гексан - ацетон (1:1, по объему), необходимый для полного вымывания фунгицида с колонки.

В круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 0,2 куб. см градуировочного раствора дифеноконазола с массовой концентрацией 2 мкг/куб. см в смеси гексан - ацетон (8:2, по объему) (п. 7.6.2). Отдувают растворитель током теплого воздуха, остаток растворяют в 1 куб. см смеси гексан - ацетон (9:1, по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на патрон Диапак-диол, подготовленный по п. 8.3. Промывают патрон 2 куб. см смеси гексан - ацетон (9:1, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в секунду, элюат отбрасывают. Затем через патрон пропускают 20 куб. см смеси гексан - ацетон (8:2, по объему), отбирая последовательно по 3 куб. см элюата. Каждую фракцию упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °С, сухие остатки растворяют в 1 куб. см смеси гексан - ацетон (8:2, по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., и затем хроматографируют в соответствии с п. 6.2.

По результатам обнаружения дифеноконазола в каждой из фракций определяют объем смеси гексан - ацетон (8:2, по объему), необходимый для полного вымывания фунгицида из патрона.

7.6.1. Исходный раствор дифеноконазола для градуировки с массовой концентрацией 100 мкг/куб. см

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают (0,010 +/- 0,0001) г дифеноконазола, растворяют в 40 - 50 куб. см смеси гексан - ацетон (8:2, по объему), доводят объем раствора этой же смесью до метки, тщательно перемешивают.

Раствор хранят в морозильной камере при температуре не выше (-18) °С в течение 3-х месяцев.

7.6.2. Градуировочный раствор дифеноконазола с массовой концентрацией 2 мкг/куб. см (раствор N 1)

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 2 куб. см исходного раствора дифеноконазола с массовой концентрацией 100 мкг/куб. см (п. 7.6.1), разбавляют смесью гексан - ацетон (8:2, по объему) до метки. Этот раствор используют для приготовления рабочих градуировочных растворов N 2 - 5.

Градуировочный раствор N 1 хранят в морозильной камере при температуре не выше (-18) °С в течение месяца.

7.6.3. Градуировочные растворы дифеноконазола с массовой концентрацией (0,02 - 0,2) мкг/куб. см (растворы N 2 - 5)

В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают 1,0; 2,0; 5,0 и 10,0 куб. см градуировочного раствора дифеноконазола с массовой концентрацией 2 мкг/куб. см (п. 8.6.2), доводят до метки смесью гексан - ацетон (8:2, по объему), тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 2 - 5 с концентрацией дифеноконазола 0,02; 0,04; 0,1 и 0,2 мкг/куб. см соответственно.

Растворы готовят непосредственно перед использованием.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (мВ х с) от массовой концентрации дифеноконазола в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4-м градуировочным растворам (п. 7.6.3).

В испаритель (инжектор) хроматографа вводят по 1 куб. мм каждого градуировочного раствора (п. 7.6.3) и анализируют при условиях п. 6.2. Осуществляют не менее 3-х параллельных определений. Расхождение между параллельными определениями не должно превышать предела повторяемости r.

По полученным данным строят градуировочную характеристику.

Контроль стабильности градуировки проводят не реже 1 раза в три месяца, а также при смене реактивов или изменении условий анализа.

Для контроля стабильности используют вновь приготовленные градуировочные растворы с массовой концентрацией исследуемого вещества в начале, середине и в конце диапазона измерений, которые анализируют в точном соответствии с методикой.

Градуировочную характеристику считают стабильной, если для каждого контрольного образца выполняется условие:

где +/- дельта - граница относительной погрешности, % (табл. 1).

Если условие стабильности не выполняется только для одного образца, то повторно анализируют этот образец для исключения результата, содержащего грубую ошибку.

Если градуировка нестабильна, выясняют причины нестабильности и повторяют контроль стабильности с использованием других образцов для градуировки, предусмотренных методикой. При повторном обнаружении нестабильности градуировки прибор градуируют заново.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.1979) и правилами, определенными ГОСТ 25896-83 "Виноград свежий столовый. ТУ" и ГОСТ 25892-83 "Сок виноградный. ТУ".

Пробы ягод хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике не более одного дня; для длительного хранения пробы замораживают и хранят при температуре (-18) °С до анализа. Сок получают из ягод непосредственно перед проведением анализа. Перед анализом ягоды измельчают.

9.1.1. Ягоды. Образец измельченного растительного материала массой 25 г помещают в стакан гомогенизатора вместимостью 500 куб. см, добавляют 100 куб. см ацетона и гомогенизируют 3 мин. при 10000 об./мин. Гомогенат переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют 5 мин. при 5000 об./мин. Надосадочную жидкость переносят в химический стакан, а осадок в центрифужной пробирке промывают 50 куб. см ацетона и суспензию фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу. Экстракт и промывную жидкость объединяют, перемешивают, измеряют объем раствора. Отбирают 1/5 объема экстракта (эквивалентную 5 г образца), переносят в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см и добавляют 30 куб. см дистиллированной воды. Раствор упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °С до водной фазы, которую переносят в делительную воронку вместимостью 100 куб. см. Далее проводят очистку экстракта по п. 9.2.

9.1.2. Сок. Навеску (10 г) свежевыжатого виноградного сока помещают в химический стакан вместимостью 100 куб. см, приливают 60 кв. см дистиллированной воды, перемешивают, измеряют объем раствора и 1/2 его часть (эквивалентную 5 г образца) переносят в делительную воронку вместимостью 100 куб. см. Далее проводят очистку экстракта по п. 9.2.

К экстрактам, полученным по п. п. 9.1.1 и 9.1.2 и помещенным в делительные воронки, приливают по 30 куб. см смеси гексан - диэтиловый эфир (4:1, по объему) и содержимое интенсивно встряхивают в течение 2-х мин. После разделения фаз верхний органический слой фильтруют через слой безводного сульфата натрия в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. Операцию экстракции водной фазы повторяют еще дважды, используя 30 и 20 куб. см смеси гексан - диэтиловый эфир (4:1, по объему). Объединенную органическую фазу, пропущенную через слой сульфата натрия, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С. Далее проводят очистку по п. 9.3.

Сухой остаток в круглодонной колбе, полученный по п. 9.2, растворяют в 0,4 куб. см ацетона, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., добавляют 1,6 куб. см гексана, перемешивают, вновь помещают в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на колонку, подготовленную по п. 7.3. Колбу обмывают 1 куб. см смеси гексан - ацетон (8:2, по объему), которые также наносят на колонку. Промывают колонку 20 куб. см смеси гексан - ацетон (7:3, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в секунду, элюат отбрасывают. Дифеноконазол элюируют с колонки 30 куб. см смеси гексан - ацетон (1:1, по объему), собирая элюат непосредственно в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. Раствор упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С и окончательную очистку экстрактов проводят по п. 9.4.

Сухой остаток в круглодонной колбе, полученный по п. 9.3, растворяют с помощью ультразвуковой ванны в 2 куб. см смеси гексан - ацетон (9:1, по объему) и переносят в подготовленный концентрирующий патрон Диапак-диол (п. 7.3). Патрон промывают 2 куб. см смеси гексан - ацетон (9:1, по объему), элюат отбрасывают. Дифеноконазол элюируют 8 куб. см смеси гексан - ацетон (8:2, по объему) в круглодонную колбу вместимостью 25 куб. см. Раствор упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток экстрактов сока и ягод растворяют соответственно в 2,5 и 5 куб. см смеси гексан - ацетон (8:2, по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., и анализируют на содержание дифеноконазола по п. 10.

10.1. В инжектор хроматографа вводят 1 куб. мм очищенного экстракта анализируемой пробы (п. п. 9.1 - 9.4), анализируют при условиях (п. 6.2) и регистрируют хроматограмму. Каждый экстракт хроматографируют дважды.

10.2. Для каждого образца ягод и сока повторяют операции по п. п. 9.1 - 9.4, 10.1.

Для обработки результатов хроматографического анализа используется программа сбора и обработки хроматографической информации "Хроматэк Аналитик", версия 1.20.

Альтернативная обработка результатов.

Массовую долю дифеноконазола X (мг/кг) в образцах ягод и сока рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

дельта - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе "менее нижней границы определения"

менее 0,02 мг/кг для ягод винограда <*>.

менее 0,01 мг/кг для виноградного сока <**>.

--------------------------------

<*> 0,02 мг/кг - предел обнаружения для ягод.

<**> 0,01 мг/кг - предел обнаружения для сока.

Экстракты, при хроматографировании которых получают аналитический сигнал дифеноконазола, превышающий аналитический сигнал, получаемый при хроматографировании градуировочного раствора с массовой концентрацией 0,2 мкг/куб. см, разбавляют, но не более чем в 10 раз, и анализируют в соответствии с данной методикой. При расчете содержания дифеноконазола учитывают разбавление.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

14.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

14.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

где ДЕЛЬТА - граница абсолютной погрешности, мг/кг (куб. дм);

дельта - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

14.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):