"МУК 4.1.2955-11. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение массовой концентрации диметилового эфира терефталевой кислоты (диметилтерефталата) в крови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 29.07.2011)

1. Разработаны Федеральным бюджетным учреждением науки "Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения" Роспотребнадзора.

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 27 июля 2011 г.

3. Введены в действие с момента утверждения.

4. Введены впервые.

Свидетельство об аттестации N 223.1.0243/01.00258/2010.

1.1. Методические указания по определению массовой концентрации диметилового эфира терефталевой кислоты (диметилтерефталата) в крови предназначены для использования органами, осуществляющими государственный санитарно-эпидемиологический надзор, лечебными и научными учреждениями, осуществляющими деятельность в области профпатологии и экологии человека, научно-исследовательскими институтами, занимающимися вопросами гигиены окружающей среды.

Методические указания разработаны с целью обеспечения контроля за содержанием диметилового эфира терефталевой кислоты в биологических средах (крови) у населения, проживающего в условиях с повышенным уровнем загрязнения окружающей среды.

1.2. Физико-химические и токсические свойства диметилового эфира терефталевой кислоты.

Структурная формула (не приводится).

Молекулярная масса 194,19.

2.1. Метод измерений массовой концентрации диметилового эфира терефталевой кислоты (диметилтерефталата) основан на концентрировании диметилтерефталата из плазмы крови методом твердофазной экстракции на полимерном сорбенте Oasis HLB и анализе экстракта на жидкостном хроматографе в градиентном режиме элюирования с использованием флуориметрического детектора.

2.2. Определению не мешают диметиловый эфир фталевой кислоты, диметиловый эфир изофталевой кислоты, монометиловые эфиры изомеров фталевой кислоты, диэтиловые эфиры изомеров фталевой кислоты, фталевая, изофталевая и терефталевая кислоты.

2.3. Диапазон измерений массовой концентрации диметилового эфира терефталевой кислоты в крови - 0,02 - 1,0 мкг/куб. см.

Погрешность измерений соответствует характеристикам, приведенным в табл. 1.

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, материалы и реактивы.

Примечания.

1. Допускается использование других средств измерений утвержденных типов, обеспечивающих измерения с установленной точностью.

2. Допускается использование другого оборудования, материалов и реактивов с метрологическими и техническими характеристиками, аналогичными указанным.

При работе с реактивами соблюдают требования безопасности по ГОСТ 12.1.007-76 и 12.1.005-88.

5.2.1. При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа соблюдают меры безопасности, указанные в "Руководстве по правилам эксплуатации" прибора, правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79, противопожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91, и имеют средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83.

5.2.2. Помещение должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией.

5.2.3. При работе с биологическими средами необходимо соблюдать правила в соответствии с требованиями СП 1.3.2322-08.

К выполнению измерений допускаются лица, имеющие квалификацию не ниже инженера-химика с опытом работы на жидкостном хроматографе, освоившие метод анализа и получившие удовлетворительные результаты оперативного контроля процедуры выполнения измерений.

7.1. При подготовке к проведению измерений и приготовлении растворов соблюдают следующие условия (ГОСТ 15150):

- температура воздуха (20 +/- 5) °С, влажность (80%);

- атмосферное давление (630 - 800) мм рт. ст.

7.2. Выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендуемых технической документацией к прибору.

Перед выполнением измерений проводят следующие работы: подготовка посуды, приготовление растворов, подготовка хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики.

Используемую посуду вымыть мыльным раствором, промыть проточной водопроводной водой, ополоснуть дистиллированной водой, обработать этиловым спиртом и высушить при температуре 50 °С.

8.2.1. Элюент для хроматографии. Смесь ацетонитрила с дистиллированной водой в соотношении 25:75% (объемная доля). Состав элюента задают на двух каналах насоса.

8.2.2. Раствор ацетонитрила 20%-й (объемная доля). В мерную колбу объемом 100 куб. см вносят 20,0 куб. см ацетонитрила, доводят дистиллированной водой до метки, перемешивают и дегазируют содержимое колбы барботированием гелия в течение 2 - 3 мин. со скоростью 50 - 60 куб. см/мин. Срок хранения раствора 5 дней.

8.2.3. Исходный раствор диметилового эфира терефталевой кислоты для градуировки (раствор N 1). Берут навеску диметилтерефталата массой (2,0 +/- 0,12) мг, переносят навеску в мерную колбу вместимостью 100 куб. см и доводят ацетонитрилом до метки. Концентрация диметилтерефталата в исходном растворе составляет 20,0 мкг/куб. см. Срок хранения раствора 7 дней при комнатных условиях.

8.2.4. Рабочий раствор диметилового эфира терефталевой кислоты для градуировки (раствор N 2). В мерную колбу вместимостью 50 куб. см вносят 2,5 куб. см раствора N 1 и доводят ацетонитрилом до метки. Массовая концентрация диметилтерефталата в рабочем растворе составляет 1,0 мкг/куб. см. Используют свежеприготовленный раствор.

8.2.5. Раствор о-фосфорной кислоты 4%-й (объемная доля). В мерную колбу объемом 100 куб. см вносят 4,0 куб. см концентрированной о-фосфорной кислоты, доводят дистиллированной водой до метки и перемешивают содержимое колбы. Срок хранения раствора 30 дней.

8.2.6. Стандартный раствор для идентификации диметилтерефталата. В мерную колбу вместимостью 25 куб. см вносят 10 куб. мм исходного раствора диметилового эфира терефталевой кислоты для градуировки (раствор N 1) и доводят содержимое колбы ацетонитрилом до метки. Концентрация диметилтерефталата составляет 0,2 мкг/куб. см. Срок хранения раствора 7 суток при комнатных условиях.

Колонку устанавливают в хроматограф и подают элюент со скоростью 1,0 куб. см/мин. до установления равновесия колонки, которое определяют по стабильности нулевой линии детектора.

8.4.1. Строят график зависимости площади хроматографического пика от массовой концентрации диметилтерефталата в крови в диапазоне 0,02 - 1,0 мкг/куб. см. Градуировочную характеристику устанавливают по шести сериям растворов для градуировки. Каждую серию, состоящую из трех растворов, готовят из растворов для градуировки (N 1 и 2), приготовленных по пп. 8.2.3 - 8.2.4.

8.4.2. Для приготовления градуировочных смесей отбирают пробу крови объемом не менее 40 куб. см, в которую добавляют 0,2 куб. см гепарина. В соответствии с п. 9 проводят анализ пробы крови на содержание диметилтерефталата. При наличии анализируемого вещества в холостой пробе вычитают его фоновое содержание при построении калибровки.

8.4.3. Градуировочные растворы готовят в пробирках мерных центрифужных П-1-10-0,1 вместимостью 10 куб. см. Для этого в каждую пробирку вносят растворы диметилового эфира терефталевой кислоты для градуировки N 1 и 2 в соответствии с табл. 2, доводят до объема 1 куб. см цельной кровью и перемешивают. Одновременно готовят холостую пробу, не содержащую исследуемого вещества. Анализируют свежеприготовленные растворы.

8.4.4. Градуировочные растворы центрифугируют со скоростью 2000 об./мин. в течение 10 мин., отбирают 0,5 куб. см плазмы в стаканчик СВ 19/9 и проводят твердофазную экстракцию. Для этого в каждый стаканчик с плазмой добавляют 1 куб. см дистиллированной воды, 6 куб. мм 4%-го раствора о-фосфорной кислоты, перемешивают и пропускают под вакуумом через картридж с сорбентом Oasis HLB 1cc, который предварительно промывают 1 куб. см ацетонитрила и 1 куб. см дистиллированной воды. Затем картридж с пропущенной через него пробой промывают 1 куб. см дистиллированной воды и 1 куб. см 20%-го раствора ацетонитрила. Затем переносят патрон с сорбентом в накопительный сосуд (бюкс) и пропускают через сорбент 0,5 куб. см ацетонитрила. Скорость потока во время экстракции не должна превышать 1 куб. см/мин. Полученный экстракт фильтруют через капроновый фильтр, используя медицинский шприц "Луер", в стеклянную виалу и аликвотную часть (10 куб. мм) анализируют на приборе.

8.4.5. Условия хроматографирования:

подвижная фаза - смесь ацетонитрила и воды в соотношении 25:75;

градиент: 10 мин. подача подвижной фазы (25% ацетонитрила и 75% воды), увеличение ацетонитрила с 25 до 90% в течение 5 мин., 5 мин. подача 90% ацетонитрила, снижение ацетонитрила до 25% в течение 5 мин., подача 25% ацетонитрила до уравновешивания колонки (10 мин.);

8.4.6. Градуировочный коэффициент рассчитывают по формуле:

8.4.7. Контроль стабильности градуировочной характеристики.

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят 1 раз в квартал в анализируемой серии измерений. Образцами для контроля стабильности являются градуировочные растворы, выбранные таким образом, чтобы массовая концентрация диметилтерефталата соответствовала нижней, верхней границам и середине диапазона построения градуировочной характеристики. Градуировка признается стабильной при выполнении условия:

где:

C - заданная массовая концентрация диметилтерефталата в градуировочном растворе;

Х - результат измерения массовой концентрации диметилтерефталата в градуировочном растворе.

При невыполнении условия стабильности градуировочной характеристики эксперимент повторяют с другим градуировочным раствором. При повторном невыполнении условия стабильности градуировочной характеристики выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики.

Отбирают венозную кровь объемом не менее 4 куб. см в мерную стеклянную пробирку с 0,05 куб. см гепарина. Срок хранения проб в холодильнике 6 ч.

Выполняют два параллельных измерения образца крови. Центрифугируют 1 куб. см крови со скоростью 2000 об./мин. в течение 5 - 10 мин. Отбирают 0,5 куб. см плазмы в стаканчик СВ 19/9, добавляют 1 куб. см дистиллированной воды, 6 куб. мм 4%-го раствора о-фосфорной кислоты и проводят твердофазную экстракцию, последовательно пропуская под вакуумом через картридж с сорбентом Oasis HLB 1cc 1 куб. см ацетонитрила, 1 куб. см дистиллированной воды, 1,5 куб. см раствора плазмы, 1 куб. см дистиллированной воды, 1 куб. см 20%-го водного раствора ацетонитрила. Затем переносят патрон с сорбентом в накопительный сосуд (бюкс) и пропускают через сорбент 0,5 куб. см ацетонитрила. Скорость потока во время экстракции не должна превышать 1 куб. см/мин. Полученный экстракт фильтруют через капроновый фильтр, используя медицинский шприц, в стеклянную виалу и аликвотную часть (10 куб. мм) анализируют в условиях, указанных в п. 8.4.5.

Идентификацию диметилтерефталата проводят путем сравнения времен удерживания хроматографических пиков в анализируемой пробе и стандартном растворе.

10.1. Массовую концентрацию диметилтерефталата в крови (мкг/куб. см) вычисляют по формуле:

При невыполнении условия (1) получают дополнительно еще два результата измерений. За результат измерений принимают среднее арифметическое четырех результатов измерений, полученных в условиях повторяемости, для которых выполняется условие:

При невыполнении условия (2) в качестве окончательного результата измерений принимают медиану четырех результатов измерений, полученных в условиях повторяемости (параллельных определений). Дополнительно выявляют и устраняют причины, приводящие к невыполнению условия (1).

10.3. Расхождение между результатами измерений, полученными в двух лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости:

При выполнении условия (3) приемлемы оба результата измерений, и в качестве окончательного может быть использовано их среднее арифметическое значение. Значения предела воспроизводимости приведены в табл. 3.

Результат измерений в документах, предусматривающих его использование, может быть представлен в виде:

Значение дельта приведено в табл. 1.

Обеспечение достоверности измерений в пределах лаборатории организуют и проводят путем проведения оперативного контроля процедуры измерений и контроля стабильности результатов измерений в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-6 и РМГ 76.

Периодичность получения результатов контрольных процедур и формы их регистрации приводят в документах лаборатории, устанавливающих порядок и содержание работ по организации методов контроля стабильности результатов измерений в пределах лаборатории.

При невыполнении условия (4) контрольную процедуру повторяют. При повторном невыполнении условия (4) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

Контрольные процедуры при контроле промежуточной прецизионности получают с использованием рабочих проб крови.

"Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения" Роспотребнадзора.