"МУК 4.1.2550-09. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств глифосата в семенах и масле рапса методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 09.09.2009)

1. Разработаны ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 25 июня 2009 г. N 2).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 9 сентября 2009 г.

4. Введены в действие с 1 декабря 2009 г.

5. Введены впервые.

Настоящие Методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации глифосата в семенах рапса в диапазоне 0,15 - 1,5 мг/кг и в масле рапса в диапазоне 0,10 - 1,0 мг/кг.

Название вещества по ИСО: глифосат.

Название вещества по ИЮПАК: N-(фосфонометил)-глицин.

Глифосат малотоксичен для человека, животных, пчел и птиц, не обладает побочными токсическими эффектами.

В России установлены следующие гигиенические нормативы.

ДСД - 0,01 мг/кг массы тела человека; МДУ в семенах рапса - 0,3 мг/кг, в масле - 0,1 мг/кг.

Область применения препарата. Глифосат - системный гербицид сплошного действия из группы ингибиторов биосинтеза ароматических аминокислот. Применяется для уничтожения злаковых и широколистных сорняков, в том числе с глубокоукореняющейся корневой системой, в посевах сельскохозяйственных культур, в садах и виноградниках, на пастбищах, откосах оросительных и осушительных каналов, промышленных территориях, а также для борьбы с кустарниками в лесных насаждениях. Помимо этого глифосат обладает способностью вызывать десикацию ряда культур, таких как подсолнечник, гречиха, соя и др.

В России глифосат применяется в качестве довсходового или допосевного гербицида на посевах сельскохозяйственных культур, а также для десикации зерновых культур, льна-долгунца, гороха, подсолнечника и сои с нормой расхода до 1,44 кг д.в. на га.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 2.

Методика основана на определении глифосата с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с флуоресцентным детектором. Контроль глифосата в матрицах осуществляется по содержанию вещества после экстракции его из семян и масла рапса подкисленной водой, очистки экстракта хлороформом и на ионообменных смолах Дауэкс 1х8 и Дауэкс 50Wх2, дериватизации глифосата с помощью 9-флуоренилметилхлорформиата в щелочной среде.

Количественное определение глифосата проводится методом абсолютной калибровки.

В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Избирательность обеспечивается путем подбора колонки, состава подвижной фазы и условий хроматографирования.

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Допускается применение другого оборудования с аналогичными или лучшими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими веществами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостной хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя с опытом работы на жидкостном хроматографе.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией "лаборант", имеющего опыт работы в химической лаборатории.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °С и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление растворов, подвижной фазы для ВЭЖХ, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики, подготовка колонок с ионообменными смолами Дауэкс 1х8 и Дауэкс 50Wх2.

7.1.2. Очистка ацетонитрила. Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора не менее 1 часа, после чего перегоняют. Непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия.

7.1.3. Очистка хлороформа. Хлороформ встряхивают с небольшими порциями концентрированной серной кислоты до тех пор, пока свежая порция кислоты не перестанет окрашиваться. Затем растворитель промывают водой, после чего сушат над пентоксидом фосфора и перегоняют.

7.1.4. Очистка диэтилового эфира. Диэтиловый эфир встряхивают со свежеприготовленным раствором железного купороса (30 г сульфата железа, 655 куб. см воды с добавлением 1,5 куб. см концентрированной серной кислоты), затем диэтиловый эфир последовательно промывают 0,5%-ным раствором перманганата калия, 5%-ным раствором гидроксида натрия и водой, после чего сушат над хлористым кальцием и перегоняют.

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см, содержащую 200 - 300 куб. см деионизованной воды, вносят 41 куб. см концентрированной HCl, перемешивают, доводят объем до метки деионизованной водой и перемешивают.

Растворы соляной кислоты других концентраций готовят из 0,5 н раствора HCl соответствующим разбавлением деионизованной водой.

40 г NaOH помещают в мерную колбу вместимостью 1000 куб. см, добавляют 500 - 600 куб. см деионизованной воды, перемешивают до полного растворения вещества, охлаждают раствор до комнатной температуры, доводят объем водой до метки и перемешивают.

31,8 мг 9-флуоренилметилхлорформиата помещают в мерную колбу вместимостью 100 куб. см, добавляют 50 - 60 куб. см ацетона, перемешивают до полного растворения вещества, доводят объем ацетоном до метки и перемешивают.

Промывают колонку для ВЭЖХ 20 куб. см смеси ацетонитрил - вода (1:1 по объему), а затем подвижной фазой для ВЭЖХ (п. 7.7) при скорости подачи растворителя 1,0 куб. см/мин. до установления стабильной базовой линии.

7.9.1. Исходный раствор глифосата для градуировки (концентрация 100 мкг/куб. см). В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 100 мг глифосата, растворяют в 400 - 500 куб. см деионизованной воды, доводят объем водой до метки, тщательно перемешивают. Раствор хранят в холодильнике при температуре 2 - 4 °С не более одного месяца.

7.9.2. Раствор глифосата N 1 для градуировки (концентрация 10 мкг/куб. см). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 10 куб. см исходного раствора глифосата с концентрацией 100 мкг/куб. см (п. 7.9.1), доводят водой объем до метки. Этот раствор используют для приготовления рабочих градуировочных растворов N 2 - 5.

Для приготовления проб семян с внесением при оценке полноты извлечения глифосата из исследуемых образцов используют водный раствор глифосата с концентрацией 10 мкг/куб. см.

Для приготовления проб масла с внесением при оценке полноты извлечения глифосата из исследуемых образцов используют растворы глифосата в 80%-ном ацетоне с концентрациями 10 и 100 мкг/куб. см.

Градуировочный раствор N 1 и растворы для фортификации хранят в холодильнике при температуре 2 - 4 °С не более одной недели.

7.9.3. Рабочие растворы N 2 - 5 глифосата для градуировки (концентрация 0,01 - 0,10 мкг/куб. см). В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают 0,1; 0,2; 0,5 и 1,0 куб. см градуировочного раствора N 1 глифосата с концентрацией 10 мкг/куб. см (п. 7.9.2), доводят объем деионизованной водой до метки, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 2 - 5 с концентрацией глифосата 0,01; 0,02; 0,05 и 0,1 мкг/куб. см соответственно.

Растворы готовят непосредственно перед использованием.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость высоты пика (мм) от концентрации глифосата в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки.

В градуированные пробирки вместимостью 10 куб. см вносят по 1,5 куб. см рабочих стандартных растворов глифосата с концентрациями 0,01; 0,02; 0,05 и 0,10 мкг/куб. см и упаривают их досуха на роторном испарителе. Сухой остаток растворяют в 1,5 куб. см 0,025 М раствора тетрабората натрия и подвергают дериватизации по п. 9.3.

В инжектор хроматографа вводят по 50 куб. мм полученных растворов флуорогенного производного глифосата и анализируют по п. 9.4. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений и находят среднее значение высоты хроматографического пика для каждой концентрации.

В подготовленную по п. 7.11 колонку с Дауэкс 1х8 вводят 5 куб. см водного раствора глифосата с концентрацией 0,4 мкг/куб. см, подщелоченного 1 М NaOH до рН 11,0. Колонку промывают 200 куб. см деионизованной воды со скоростью 5 куб. см/мин. и элюат отбрасывают. Затем через колонку последовательно пропускают 50 куб. см 0,01 н HCl и 100 куб. см 0,03 н HCl со скоростью 2 куб. см/мин. Фракционно (по 10 куб. см) отбирают элюат, упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 40 °С, и эту операцию повторяют трижды с последовательно вносимыми 5 куб. см порциями деионизованной воды для удаления следов кислоты. Остатки растворяют в 1,5 куб. см 0,025 М тетрабората натрия, подвергают дериватизации по п. 9.3 и анализируют на содержание глифосата по п. 9.4.

Фракции, содержащие глифосат, объединяют и вновь анализируют по п. 9.4. Рассчитывают содержание вещества в элюате, определяют полноту смывания с колонки и необходимый для очистки объем элюента.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79) и правилами, определенными ГОСТ 10852-86 "Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб" и ГОСТ 8988-77 "Масло рапсовое, ТУ".

Пробы семян высушивают до стандартной влажности и хранят в сухом проветриваемом помещении. Масло хранят в полиэтиленовой таре в холодильнике при температуре 4 - 6 °С. В некоторых случаях масло получают из семян рапса экстракцией органическими неполярными растворителями (петролейный и диэтиловый эфиры) непосредственно перед проведением анализа.

Перед анализом образцы семян размалывают на мельнице.

9.1.1. Семена. Навеску (10 г) размолотых семян рапса помещают в коническую колбу вместимостью 250 куб. см, приливают 125 куб. см 0,1 н HCl и перемешивают в течение 30 мин. на аппарате для встряхивания. Суспензию центрифугируют 10 мин. при 5000 g. Надосадочную жидкость декантируют в мерный цилиндр, осадок повторно обрабатывают 50 куб. см 0,1 н HCl, центрифугируют и полученный экстракт объединяют с первым. Отбирают 1/2 объема раствора, эквивалентного 5 г образца, и переносят в делительную воронку вместимостью 250 куб. см. Добавляют 30 куб. см хлороформа и содержимое энергично встряхивают в течение 1 мин. После разделения слоев хлороформную фракцию отбрасывают. Водную фазу подщелачивают 1 М NaOH до рН 11,0 и центрифугируют 5 мин. при 5000 g. Супернатант декантируют в мерный цилиндр и доводят деионизованной водой до объема 100 куб. см. Дальнейшую очистку проводят по п. 9.2.

9.1.2. Масло. Навеску (5 г) масла помещают в делительную воронку вместимостью 100 куб. см, приливают 50 куб. см 0,1 н HCl и энергично встряхивают в течение 1 - 2 мин. Нижний водный слой отделяют, а масло повторно обрабатывают 30 куб. см 0,1 н HCl. Объединенные водные экстракты переносят в делительную воронку вместимостью 250 куб. см, добавляют 50 куб. см хлороформа и энергично встряхивают в течение 1 мин. После разделения слоев нижнюю хлороформную фракцию отбрасывают, а водную фазу подщелачивают 1 М NaOH до рН 11,0 и центрифугируют 5 мин. при 5000 g. Супернатант декантируют в мерный цилиндр и доводят деионизованной водой до объема 100 куб. см. Дальнейшую очистку проводят по п. 9.2.

Аликвоты экстрактов семян и масла объемом 12 куб. см (из пп. 9.1.1 и 9.1.2) пропускают через колонку с Дауэкс 1х8 (п. 7.11) со скоростью 2 куб. см/мин. Колонку последовательно промывают 200 куб. см воды и 50 куб. см 0,01 н HCl со скоростью 5 куб. см/мин., которые отбрасывают. Глифосат элюируют 60 куб. см 0,03 н HCl со скоростью 2 куб. см/мин. Полученный элюат пропускают через колонку с Дауэкс 50Wх2 (п. 7.12) со скоростью 2 куб. см/мин. Отбрасывают первые 5 куб. см элюата и собирают в грушевидную колбу остальной элюат. Колонку промывают 10 куб. см 0,03 н HCl и элюат объединяют с ранее полученным. Объединенный элюат упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 40 °С, и эту операцию повторяют трижды с последовательно вносимыми 5 куб. см порциями деионизованной воды для удаления следов кислоты. Сухой остаток экстракта рапсового масла растворяют в 6 куб. см, а семян в 9 куб. см 0,025 М раствора тетрабората натрия. Отбирают аликвоту раствора объемом 1,5 куб. см, переносят в градуированную пробирку с пришлифованной пробкой вместимостью 10 куб. см и подвергают дериватизации по п. 9.3.

К 1,5 куб. см приготовленного для дериватизации раствора глифосата (п. 7.10) или образца (п. 9.2) прибавляют 1,5 куб. см 0,001 М ацетонового раствора 9-флуоренилметилхлорформиата (п. 7.6) и содержимое хорошо перемешивают. Реакционную смесь выдерживают 20 мин. при комнатной температуре, а затем трижды обрабатывают 2 куб. см порциями диэтилового эфира для удаления избытка флуорогенного реактива. К водному остатку добавляют деионизованной воды до объема 2,5 куб. см. 0,5 куб. см водного раствора переносят в мерную пробирку вместимостью 5 куб. см, прибавляют 4,5 куб. см подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 7.7), перемешивают и анализируют на содержание глифосата по п. 9.4.

Жидкостной хроматограф фирмы Altex, мод. 322 (США) с флуоресцентным детектором фирмы Shimadzu, мод. RF-5301 (Япония).

Хроматографическая колонка стальная, 4 х 150 мм, заполненная Диасорб-130-Амин (7 мкм).

Чувствительность детектора: 4.

Объем вводимой пробы: 50 куб. мм.

Время удерживания глифосата: около 9 мин.

Линейный диапазон детектирования: 0,03 - 1,5 нг.

Каждую анализируемую пробу вводят 3 раза и вычисляют среднюю высоту пика.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор с концентрацией 0,1 мкг/куб. см, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

Содержание глифосата рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

где дельта - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе "менее нижней границы определения"

< 0,15 <*> мг/кг для семян рапса.

< 0,10 <**> мг/кг для масла рапса.

--------------------------------

<*> 0,15 мг/кг - предел обнаружения для семян рапса.

<**> 0,10 мг/кг - предел обнаружения для масла рапса.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

ВНИИ фитопатологии.