"МУК 4.1.2174-07. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств Фамоксадона в плодах томатов, ягодах винограда, зеленой массе, семенах и масле подсолнечника методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 15.02.2007)

1. Методические указания подготовлены Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана при участии специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко.

4. Введены впервые.

Настоящие Методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации Фамоксадона в диапазоне 0,02 - 0,2 мг/кг в плодах томатов и ягодах винограда и в диапазоне 0,05 - 0,5 мг/кг в зеленой массе, семенах и масле подсолнечника.

Фирма-производитель: Дюпон де Немур Интернэшнл С.А.

Торговое название: Танос (смесевой препарат с Цимоксанилом).

Название действующего вещества по ИСО: Фамоксадон.

Название действующего вещества по ИЮПАК: 3-анилино-5-метил-5-(4-феноксифенил)-2,4-оксазолидиндион.

Структурная формула (не приводится).

В винограде, томатах и картофеле остаточные количества Фамоксадона обнаруживаются до сбора урожая, в клубнях картофеля остатков не было обнаружено.

В России для Фамоксадона установлены следующие гигиенические нормативы: ДСД - 0,01 мг/кг массы тела человека; ОДК в почве - 0,1 мг/кг; ПДК в воде водоемов - 0,01 (общ.) мг/куб. дм; МДУ в картофеле - 0,05 мг/кг. Для плодов томатов, ягод винограда, зерна хлебных злаков, семян и масла подсолнечника МДУ не установлен.

Область применения: Фамоксадон - фунгицид контактного действия из группы оксазолидиндионов. Является ингибитором митохондриального дыхания, высокоэффективен против широкого спектра патогенных грибов с рекомендуемой нормой расхода 50 - 200 г/га.

Зарегистрирован в России компанией Дюпон де Немур Интернэшнл С.А. под торговым названием Танос (смесевой препарат с Цимоксанилом) для борьбы против фитофтороза и альтернариоза на картофеле с нормой расхода 0,6 кг/га, также разрешено применение препарата в личных подсобных хозяйствах против фитофтороза и альтернариоза на картофеле с нормой расхода 15 г/10 л воды.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в таблице 2.

Методика основана на определении Фамоксадона методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием ультрафиолетового детектора после его экстракции из образцов органическим растворителем, очистке перераспределением между двумя несмешивающимися фазами, на колонках с Флоризилом и на концентрирующих патронах на основе силикагеля (Диапак С, Диапак С16 и Диапак Амин).

Идентификация веществ проводится по времени удерживания, а количественное определение - методом абсолютной калибровки.

В предлагаемых условиях анализа метод специфичен и может применяться для определения остатков Фамоксадона в присутствии других пестицидов. Избирательность метода достигается за счет подбора колонки и состава подвижной фазы.

Хроматограф жидкостной Уотерс 510 с ультрафиолетовым детектором с изменяемой длиной волны и чувствительностью не ниже 0,005 единиц адсорбции на шкалу или другой аналогичного типа.

Весы аналитические ВЛА-200, ГОСТ 24104-2001.

Весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания до 500 г и пределом допустимой погрешности +/- 0,038 г, ГОСТ 19491-74.

Колбы мерные на 25, 50 и 100 куб. см, ГОСТ 1770-74.

Микрошприц для жидкостного хроматографа на 50 - 100 куб. мм.

Пипетки мерные на 1,0; 2,0 и 5,0 куб. см, ГОСТ 20292-74.

Допускается использование средств измерений с аналогичными или лучшими характеристиками.

Фамоксадон, аналитический стандарт с содержанием действующего вещества 97,7% (фирма Дюпон де Немур Интернэшнл С.А).

Ацетон, ос.ч., ТУ 2633-00-4-11291058-94.

Ацетонитрил, ос.ч., УФ-205 нм, ТУ 6-09-2167-84.

Вода бидистиллированная деионизированная, ГОСТ 7602-72.

Гексан, х.ч., для спектроскопии, ТУ 6-09-06-657-84.

Калий марганцовокислый, ч.д.а., ГОСТ 20490-75.

Кальций хлористый, х.ч., ГОСТ 4161-76.

Кислота ортофосфорная, х.ч., ГОСТ 6552-80.

Метилен хлористый, х.ч., ТУ 6-09-2662-77.

Натрий сернокислый безводный, х.ч., ГОСТ 4166-76.

Натрий хлористый, х.ч., ГОСТ 4233-77.

Этиловый эфир уксусной кислоты, ч.д.а., ГОСТ 22300-76.

Концентрирующие патроны Диапак С (0,6 г), ТУ 4215-002-05451931-94.

Концентрирующие патроны Диапак С16 (0,6 г), ТУ 4215-002-05451931-94.

Концентрирующие патроны Диапак Амин (0,6 г), ТУ 4215-002-05451931-94.

Флоризил для колоночной хроматографии, 60 - 100 меш, фирма Мерк.

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичными или лучшими характеристиками.

Аллонж прямой с отводом для вакуума для работы с концентрирующими патронами Диапак С, Диапак С16 и Диапак Амин.

Аппарат для встряхивания проб АВУ-1, ТУ 64-1-1081-73.

Банки с крышками для экстракции на 250 куб. см, полипропилен, кат. N 3120-0250, NALGENE.

Ванна ультразвуковая UM-4, фирма Unitra.

Воронки делительные на 250 и 500 куб. см, ГОСТ 25336-82Е.

Воронки конические стеклянные диаметром 50 - 60 мм, ГОСТ 25336-82Е.

Испаритель ротационный Rota vapor R110 Buchi с водяной баней В-480.

Колонка хроматографическая стальная длиной 250 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, Symmetry Shield RP18, зернение 5 мкм, фирма Уотерс.

Колонки для адсорбционной хроматографии длиной 15 см, диаметр 1,5 см.

Колбы конические плоскодонные на 500 и 1000 куб. см, ГОСТ 9737-70.

Концентраторы грушевидные и круглодонные объемом 100 и 250 куб. см, ГОСТ 10394-75.

Насос вакуумный диафрагменный FT.19 фирмы KNF Neu Laboport.

Предколонка хроматографическая стальная, Symmetry C18, длиной 20 мм, внутренним диаметром 3,9 мм, зернение 5 мкм, фирма Уотерс.

Стаканы стеклянные на 100 - 500 куб. см, ГОСТ 25366-80Е.

Установка для перегонки растворителей.

Фильтры бумажные "красная лента", ТУ-6-09-1678-86.

Фильтры для очистки растворителей диаметром 20 мм с отверстиями пор 20 мкм, фирма Уотерс.

Допускается использование оборудования с аналогичными или лучшими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на жидкостном хроматографе.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией "лаборант", имеющего опыт работы в химической лаборатории.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °С и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, подготовка концентрирующих патронов Диапак С, Диапак С16 и Диапак Амин и колонок с Флоризилом для очистки экстракта, проверка хроматографического поведения вещества на патронах, колонках с Флоризилом, построение калибровочной кривой.

7.1.1. Очистка ацетона.

Ацетон перегоняют над небольшим количеством перманганата калия (А. Гордон, Р. Форд. Спутник химика. Москва, 1976, с. 438 - 439).

7.1.2. Очистка ацетонитрила.

Ацетонитрил перегоняют.

7.1.3. Очистка гексана.

Гексан встряхивают с концентрированной серной кислотой, промывают бледно-розовым раствором перманганата калия до тех пор, пока раствор не перестанет обесцвечиваться, затем промывают водой, сушат над безводным хлористым кальцием и перегоняют (А. Гордон, Р. Форд. Спутник химика. Москва, 1976, с. 441).

7.1.4. Очистка хлористого метилена.

Хлористый метилен встряхивают с концентрированной серной кислотой, промывают водным раствором карбоната натрия, водой, сушат над безводным хлористым кальцием и перегоняют над оксидом (V) фосфора (А. Гордон, Р. Форд. Спутник химика. Москва, 1976, с. 440).

7.1.5. Очистка этилового эфира уксусной кислоты.

Этиловый эфир уксусной кислоты промывают равным объемом 5%-ного раствора соды, сушат над безводным хлористым кальцием (Беккер Г. и др. Органикум. Москва, 1979, с. 372), кипятят в течение 1 часа с прокаленным сульфатом магния и затем перегоняют.

7.1.6. Очистка бидистиллированной воды.

Бидистиллят кипятят в течение 6 часов с марганцовокислым калием, добавленным из расчета 1 г/л, и затем перегоняют.

7.2.1. Приготовление растворов для жидкостной хроматографии.

Для приготовления подвижной фазы используют свежеперегнанные ацетонитрил и очищенную воду.

7.2.1.1. Приготовление 3,1 мМ раствора ортофосфорной кислоты.

В мерную колбу объемом 2,0 куб. дм помещают 500 куб. см очищенной воды и 0,42 куб. см концентрированной (85%) ортофосфорной кислоты, перемешивают, доводят до метки очищенной водой и еще раз перемешивают.

7.2.1.2. Приготовление подвижной фазы для ВЭЖХ.

В плоскодонную колбу объемом 1 куб. дм помещают 650 куб. см ацетонитрила и 350 куб. см 3,1 мМ раствора ортофосфорной кислоты в очищенной воде. Смесь тщательно перемешивают, пропускают через нее газообразный гелий со скоростью 20 куб. см в мин. в течение 5 минут, после чего помещают в ультразвуковую ванну для удаления растворенных газов на 1 минуту.

7.2.2. Приготовление градуировочных растворов.

7.2.2.1. Стандартный раствор с концентрацией Фамоксадона 1,0 мг/куб. см.

Взвешивают 100 мг Фамоксадона в мерной колбе объемом 100 куб. см. Навеску растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом.

7.2.2.2. Стандартный раствор с концентрацией Фамоксадона 10,0 мкг/куб. см.

Из стандартного раствора Фамоксадона с концентрацией 1,0 мг/куб. см отбирают пипеткой 1 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 100 куб. см и доводят объем до метки ацетонитрилом при перемешивании.

7.2.2.3. Стандартные растворы Фамоксадона с концентрацией 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 мкг/куб. см для построения калибровочной кривой и внесения в растительные образцы (за исключением масличных культур).

Методом последовательного разведения ацетонитрилом готовят растворы, содержащие по 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 мкг/куб. см и используют эти растворы для хроматографического исследования.

7.2.2.4. Стандартные растворы Фамоксадона с концентрацией 5,0; 2,0; 1,0 и 0,5 мкг/куб. см для внесения в образцы семян и масла подсолнечника.

Для внесения в исследуемые образцы семян и масла подсолнечника готовят растворы Фамоксадона в ацетоне. Из раствора Фамоксадона в ацетонитриле с концентрацией 1,0 мг/куб. см методом последовательного разведения ацетоном готовят растворы, содержащие 5,0; 2,0; 1,0 и 0,5 мкг/куб. см Фамоксадона.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади (высоты) пика от концентрации Фамоксадона в растворе, устанавливают методом абсолютной калибровки по стандартным растворам с концентрациями 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 мкг/куб. см.

Для построения градуировочного графика в инжектор хроматографа вводят по 20 куб. мм каждого градуировочного раствора и хроматографируют в условиях п. 9.6. Проводят не менее 3 параллельных измерений и находят среднее значение площади хроматографического пика для каждой концентрации. По полученным данным строят градуировочный график зависимости площади хроматографического пика в мВ от концентрации Фамоксадона в растворе в мкг/куб. см.

7.4.1. Подготовка концентрирующего патрона Диапак С и Диапак Амин для очистки экстракта.

Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 куб. см/мин.

Патрон Диапак С устанавливают на аллонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 куб. см (используют как емкость для элюентов).

Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают последовательно 10 куб. см смеси гексан - ацетон в соотношении 1:1 и 10 гексана. Элюат отбрасывают.

Нельзя допускать высыхания поверхности патрона.

7.4.1.1. Проверка хроматографического поведения Фамоксадона на концентрирующем патроне Диапак С и Диапак Амин.

Из стандартного раствора Фамоксадона в ацетонитриле, содержащего 1 мкг/куб. см отбирают 1 куб. см, помещают в круглодонную колбу объемом 100 куб. см и выпаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 1 куб. см ацетона, помещают на 10 секунд в ультразвуковую ванну и тщательно обмывают стенки концентратора. Затем в концентратор добавляют 9 куб. см гексана, смесь тщательно перемешивают и полученный раствор вносят на патрон. Элюат собирают в концентратор, выпаривают досуха, сухой остаток растворяют в 2 куб. см ацетонитрила и хроматографируют.

Исходный концентратор обмывают 10 куб. см смеси гексан - ацетон в соотношении 9:1 и двумя порциями по 5 куб. см смеси гексан - ацетон в соотношении 9:1 и последовательно вносят на патрон. Элюаты после прохождения каждой порции собирают в отдельные концентраторы, выпаривают досуха, сухой остаток растворяют в 2 куб. см ацетонитрила и хроматографируют. Определяют фракции, содержащие Фамоксадон, и объединяют их.

7.4.2. Подготовка концентрирующего патрона Диапак С16 для очистки экстракта.

Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 куб. см/мин. При работе на патронах Диапак С16 используют очищенную воду.

Патрон Диапак С16 устанавливают на аллонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 куб. см (используют как емкость для элюентов).

Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают 5 куб. см смеси ацетонитрил - вода в соотношении 1:1 и 20 куб. см воды. Элюат отбрасывают.

Нельзя допускать высыхания поверхности патрона!

7.4.2.1. Проверка хроматографического поведения Фамоксадона на концентрирующем патроне Диапак С16.

Из стандартного раствора Фамоксадона в ацетонитриле, содержащего 1 мкг/куб. см, отбирают 1 куб. см, помещают в круглодонную колбу объемом 100 куб. см и выпаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 1 куб. см ацетонитрила и тщательно обмывают стенки концентратора. Затем в концентратор добавляют 9 куб. см воды, смесь тщательно перемешивают и полученный раствор вносят на патрон. Элюат собирают в концентратор, выпаривают досуха, сухой остаток растворяют в 2 куб. см ацетонитрила и хроматографируют.

Исходный концентратор обмывают 10 куб. см смеси ацетонитрил - вода в соотношении 1:4 и смесь вносят на патрон. Элюат выпаривают досуха, сухой остаток растворяют в 2 куб. см ацетонитрила и хроматографируют.

Исходный концентратор вновь обмывают 10 куб. см смеси ацетонитрил - вода в соотношении 1:2 и смесь вносят на патрон. Элюат выпаривают досуха, сухой остаток растворяют в 2 мл ацетонитрила и хроматографируют.

Тот же концентратор обмывают двумя порциями по 10 куб. см смеси ацетонитрил - вода в соотношении 1:1 и вносят на патрон. Элюат после прохождения каждой порции выпаривают досуха, сухой остаток растворяют в 2 куб. см ацетонитрила и хроматографируют. Определяют фракции, содержащие Фамоксадон, и объединяют их.

7.4.3. Подготовка колонки с Флоризилом для очистки экстракта.

7.4.3.1. Подготовка Флоризила.

Для получения стандартизованного сорбента Флоризил выдерживают в сушильном шкафу при температуре +120 °С в течение 4 часов, а затем при постоянном перемешивании в стеклянной колбе с притертой пробкой к 95 г Флоризила (60 - 100 меш, Merck) добавляют постепенно 5 г очищенной воды.

7.4.3.2. Подготовка колонки с Флоризилом.

В пластиковую или стеклянную колонку диаметром 15 мм помещают 4 г стандартизованного Флоризила. Сверху на Флоризил насыпают 1 г безводного сульфата натрия. Перед использованием колонку промывают 10 куб. см смеси гексан - этилацетат в соотношении 3:1, избыток растворителя с колонки удаляют путем продавливания воздуха. Затем колонку дополнительно промывают 10 куб. см гексана. Перед внесением образца колонку увлажняют 5 куб. см гексана.

7.4.3.3. Проверка хроматографического поведения Фамоксадона на колонке.

В круглодонную колбу объемом 50 куб. см вносят 1 куб. см стандартного раствора Фамоксадона с концентрацией 1 мкг/куб. см и выпаривают досуха при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 0,5 куб. см этилацетата, затем добавляют в колбу 5 куб. см гексана и полученную смесь вносят на колонку. Колонку промывают 15 куб. см смеси гексан - этилацетат 10:1 и элюат отбрасывают. Фамоксадон элюируют с колонки последовательно 6-ю порциями объемом 5 куб. см смеси гексана с этилацетатом в соотношении 3:1, каждую порцию собирают отдельно в концентраторы и выпаривают досуха при температуре не выше 30 °С.

Сухой остаток после упаривания каждой фракции растворяют в 1 куб. см ацетонитрила и 20 куб. мм пробы вводят в хроматограф. Рассчитывают содержание вещества в элюате, определяют полноту смывания с колонки и необходимый для очистки объем элюента.

Примечание: Хроматографическое поведение Фамоксадона на колонке обязательно проверяют при отработке методики и каждый раз при использовании новой партии Флоризила.

Хроматографическую колонку Symmetry Shield RP18 с предколонкой Symmetry C18 устанавливают в термостате хроматографа и стабилизируют при температуре 25 °С и скорости потока подвижной фазы 1 куб. см/мин. 3 - 4 часа.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79), а также в соответствии с ГОСТ 1725-85 "Томаты свежие. ТУ", ГОСТ 25896-83 "Виноград свежий столовый. ТУ", ГОСТ 22391-89 "Подсолнечник. Требования при заготовках и поставках", ГОСТ 1129-93 "Масло подсолнечника. ТУ", ГОСТ 10852-86 "Семена масличные. Правило приемки и методы отбора проб".

Пробы томатов, винограда и зеленой массы подсолнечника хранят в холодильнике в полиэтиленовых пакетах при температуре 0 - 4 °С в течение суток. Для длительного хранения пробы замораживают и хранят в морозильной камере при температуре -18 °С.

Пробы семян подсолнечника подсушивают до стандартной влажности и хранят в бумажных или тканевых мешочках в сухом хорошо проветриваемом шкафу, недоступном для грызунов, не более 6 месяцев. Влажные семена замораживают и хранят в морозильной камере при -18 °С до 1 года.

Пробы масла подсолнечника хранят в плотно закрытой стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике при температуре 0 - 4 °С в течение 10 суток.

9.1.1. Экстракция.

Образец измельченных ягод винограда массой 10 г помещают в коническую колбу объемом 250 куб. см, прибавляют 30 куб. см ацетонитрила и помещают в ультразвуковую ванну на 5 минут. Затем колбу выдерживают 5 минут на механическом встряхивателе при комнатной температуре, экстракт фильтруют в плоскодонную колбу объемом 250 куб. см с 5 г сухого хлорида натрия. Экстракцию повторяют еще 2 раза в тех же условиях, используя по 30 куб. см ацетонитрила. Экстракты объединяют в плоскодонной колбе объемом 250 куб. см с 5 г сухого хлорида натрия, перемешивают и выдерживают при комнатной температуре 10 минут, переносят в делительную воронку объемом 250 куб. см и отбрасывают нижний водный слой.

9.1.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей.

К ацетонитрильному экстракту в делительной воронке прибавляют 30 куб. см гексана и интенсивно встряхивают воронку 2 минуты. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний ацетонитрильный слой помещают в химический стакан объемом 150 куб. см, верхний гексановый слой отбрасывают. Ацетонитрильный экстракт возвращают в делительную воронку и промывают еще двумя порциями гексана объемом по 30 куб. см. Гексан отбрасывают.

Ацетонитрильный экстракт (нижний слой) собирают в концентратор объемом 250 куб. см через слой безводного сульфата натрия. Осушитель затем обмывают 10 куб. см ацетонитрила, смыв объединяют с основным экстрактом в концентраторе и ацетонитрильный экстракт выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С. Далее проводят очистку на концентрирующих патронах.

9.1.3. Очистка экстракта на концентрирующем патроне Диапак С16.

Сухой остаток, полученный по п. 9.1.2, растворяют в 1 куб. см ацетонитрила, добавляют 9 куб. см воды и наносят на патрон Диапак С16. Элюат отбрасывают.

Концентратор обмывают 10 куб. см смеси ацетонитрил - вода в соотношении 1:4, смесь наносят на патрон и элюат отбрасывают.

Обмывают концентратор 20 куб. см смеси ацетонитрил - вода в соотношении 1:1, смесь наносят на патрон и элюат собирают в чистый концентратор. Жидкость выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

9.1.4. Очистка экстракта на концентрирующем патроне Диапак С.

Сухой остаток растворяют в 1 куб. см ацетона, помещают на 10 секунд в ультразвуковую ванну и обмывают стенки концентратора. Затем в концентратор добавляют 9 куб. см гексана, смесь тщательно перемешивают и полученный раствор наносят на патрон Диапак С. Элюат собирают в чистый концентратор. Концентратор еще раз тщательно обмывают двумя порциями смеси гексан - ацетон в соотношении 9:1 по 10 и 5 куб. см и элюат также вносят на патрон. Элюаты собирают, объединяют и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

Сухой остаток растворяют в 4 куб. см ацетонитрила и хроматографируют.

После хроматографирования каждой пробы следует промывать хроматографическую колонку в ВЭЖХ-системе не менее 10 минут.

9.2.1. Экстракция.

Образец измельченных плодов томата массой 20 г помещают в коническую колбу объемом 250 куб. см, прибавляют 30 куб. см ацетонитрила и помещают в ультразвуковую ванну на 5 минут. Затем колбу выдерживают 5 минут на механическом встряхивателе при комнатной температуре, фильтруют в плоскодонную колбу объемом 250 куб. см с 5 г сухого хлорида натрия. Далее экстракцию проводят, как описано в п. 9.1.1 (Ягоды винограда).

9.2.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей.

Очистку экстракта перераспределением проводят, как описано в п. 9.1.2.

9.2.3. Очистка экстракта на концентрирующих патронах Диапак Амин и Диапак С16.

Сухой остаток растворяют в 1 куб. см ацетона, помещают на 10 секунд в ультразвуковую ванну и обмывают стенки концентратора. Затем в концентратор добавляют 9 куб. см гексана, смесь тщательно перемешивают и полученный раствор вносят на патрон Диапак Амин. Концентратор тщательно обмывают двумя порциями смеси гексан - ацетон в соотношении 9:1 по 10 и 5 куб. см и также вносят на патрон. Элюаты собирают, объединяют, выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

Сухой остаток, полученный по п. 9.1.2, растворяют в 1 куб. см ацетонитрила, добавляют 9 куб. см воды и наносят на патрон Диапак С16. Элюат отбрасывают.

Концентратор обмывают 10 куб. см смеси ацетонитрил - вода в соотношении 1:4, смесь наносят на патрон и элюат отбрасывают.

Концентратор еще раз обмывают 10 куб. см смеси ацетонитрил - вода в соотношении 1:2, смесь наносят на патрон и элюат отбрасывают.

Обмывают концентратор 20 куб. см смеси ацетонитрил - вода в соотношении 1:1, смесь наносят на патрон и элюат собирают в чистый концентратор. Жидкость выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

Сухой остаток растворяют в 4 куб. см ацетонитрила и аликвоту 20 куб. мм вводят в хроматограф.

После хроматографирования каждой пробы следует промывать хроматографическую колонку в ВЭЖХ-системе не менее 10 минут.

9.3.1. Экстракция.

Образец измельченных семян подсолнечника массой 10 г помещают в коническую колбу объемом 250 куб. см, прибавляют 75 куб. см смеси ацетонитрила с ацетоном в соотношении 9:1 и помещают в ультразвуковую ванну на 10 минут. Затем колбу выдерживают 5 минут на механическом встряхивателе при комнатной температуре и фильтруют в концентратор объемом 250 куб. см. Экстракцию повторяют еще два раза в тех же условиях, используя по 75 куб. см смеси растворителей. Экстракты объединяют в концентраторе и упаривают до маслянистого остатка на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

9.3.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей.

К маслянистому остатку в концентраторе, полученному по п. 9.3.1, прибавляют 20 куб. см гексана, обмывают стенки колбы и переносят смыв в сухую делительную воронку объемом 250 куб. см. Концентратор обмывают еще двумя порциями гексана объемом по 20 и 10 куб. см и объединяют все смывы в делительной воронке.

Фамоксадон экстрагируют из гексанового раствора тремя порциями ацетонитрила объемом по 20 куб. см. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний ацетонитрильный слой собирают в концентратор объемом 250 куб. см через слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Гексан отбрасывают. Ацетонитрильный экстракт упаривают до маслянистого остатка на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

Маслянистый остаток растворяют в 50 куб. см гексана, переносят в сухую делительную воронку объемом 250 куб. см и экстрагируют Фамоксадон тремя порциями ацетонитрила объемом по 20 куб. см, встряхивая делительную воронку по 2 минуты. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний ацетонитрильный слой собирают в концентратор объемом 250 куб. см через слой безводного сульфата натрия толщиной 1 см. Гексан отбрасывают. Ацетонитрильный экстракт упаривают до маслянистого остатка на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

9.3.3. Очистка экстракта на колонках с Флоризилом.

Сухой остаток, полученный по п. 9.3.2, растворяют в 0,5 куб. см этилацетата, обмывая стенки концентратора, затем в концентратор прибавляют 5 мл гексана, тщательно перемешивают и полученную смесь вносят на колонку. Колонку промывают 15 куб. см смеси гексан - этилацетат в соотношении 10:1 и элюат отбрасывают. Фамоксат элюируют с колонки 20 куб. см смеси гексан - этилацетат в соотношении 3:1, собирают в концентратор и выпаривают досуха при температуре не выше 30 °С.

9.3.4. Очистка экстракта на концентрирующих патронах Диапак С и Диапак С16.

Сухой остаток растворяют в 1 куб. см ацетонитрила, добавляют 9 куб. см воды и очищают на патроне Диапак С16, как указано в п. 9.1.3. После очистки элюат выпаривают досуха, растворяют в 1 куб. см ацетонитрила, добавляют 9 куб. см воды и еще раз очищают на патроне Диапак С. После очистки элюат выпаривают досуха, растворяют в 5 куб. см ацетонитрила и хроматографируют.

9.4.1. Экстракция.

Образец масла подсолнечника массой 10 г помещают в коническую колбу объемом 250 куб. см, прибавляют 100 куб. см гексана и 5 г безводного сульфата натрия и помещают на 15 минут на механический встряхиватель. Затем гексаново-масляный раствор декантируют в делительную воронку объемом 250 куб. см, осушитель оставляют в колбе и отбрасывают. Из гексана Фамоксадон экстрагируют тремя порциями ацетонитрила объемом по 30 куб. см, встряхивая делительную воронку по 2 минуты. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний ацетонитрильный слой собирают в концентратор объемом 250 куб. см через слой безводного сульфата натрия толщиной 1 см. Экстракты объединяют в концентраторе и упаривают до маслянистого остатка на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

9.4.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей.

Маслянистый остаток, полученный по п. 9.4.1, растворяют в 50 куб. см гексана, переносят в делительную воронку объемом 250 куб. см. Из гексановой фазы Фамоксадон экстрагируют тремя порциями ацетонитрила объемом по 20 куб. см, встряхивая делительную воронку по 2 минуты. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний ацетонитрильный слой собирают в концентратор объемом 250 куб. см через слой безводного сульфата натрия толщиной 1 см. Гексан отбрасывают. Ацетонитрильный экстракт упаривают до маслянистого остатка на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

9.4.3. Очистка экстракта на колонках с Флоризилом и на концентрирующих патронах Диапак С и Диапак С16.

Маслянистый остаток, полученный по п. 9.4.2, растворяют в 0,5 куб. см этилацетата, добавляют 5 куб. см гексана и очищают на колонках с Флоризилом, как указано в п. 9.3.3. После очистки элюат выпаривают досуха, растворяют в 1 куб. см ацетонитрила, добавляют 9 куб. см воды и очищают на патроне Диапак С16, как указано в п. 9.1.3. После очистки элюат выпаривают досуха, растворяют в 1 куб. см ацетонитрила, добавляют 9 куб. см воды и еще раз очищают на патроне Диапак С16, как указано в п. 7.5.2.2. После очистки элюат выпаривают досуха, растворяют в 5 куб. см ацетонитрила и хроматографируют.

9.5.1. Экстракция.

Образец измельченной зеленой массы подсолнечника массой 10 г помещают в коническую колбу объемом 250 куб. см, прибавляют 50 куб. см ацетонитрила и помещают в ультразвуковую ванну на 5 минут. Затем колбу выдерживают 5 минут на механическом встряхивателе при комнатной температуре и фильтруют в плоскодонную колбу объемом 250 куб. см с 5 г сухого хлорида натрия. Экстракцию повторяют еще два раза в тех же условиях, используя по 50 куб. см ацетонитрила. Экстракты объединяют в плоскодонной колбе объемом 250 куб. см с 5 г сухого хлорида натрия, перемешивают и выдерживают при комнатной температуре 10 минут. Затем экстракт переносят в делительную воронку объемом 250 куб. см и отбрасывают нижний водный слой.

9.5.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей.

К ацетонитрильному экстракту в делительной воронке прибавляют 50 куб. см гексана и интенсивно встряхивают воронку 2 минуты. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний ацетонитрильный слой помещают в химический стакан объемом 150 куб. см, верхний гексановый слой отбрасывают. Ацетонитрильный экстракт возвращают в делительную воронку и промывают еще одной порцией гексана объемом 50 куб. см. Гексан отбрасывают. Ацетонитрильный экстракт (нижний слой) собирают в концентратор объемом 250 куб. см через слой безводного сульфата натрия. Осушитель затем обмывают 10 куб. см ацетонитрила, смыв объединяют с основным экстрактом и ацетонитрильный экстракт выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

К сухому остатку в концентраторе прибавляют 40 куб. см хлористого метилена, обмывают стенки концентратора и переносят смыв в делительную воронку объемом 500 куб. см. Затем концентратор обмывают еще двумя порциями хлористого метилена объемом по 30 куб. см и все смывы объединяют в делительной воронке.

Туда же прибавляют 100 куб. см дистиллированной воды, 10 куб. см 0,1%-ного раствора перманганата калия и встряхивают воронку 2 минуты. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний слой хлористого метилена помещают в химический стакан объемом 150 куб. см, верхний водный слой отбрасывают.

Хлористый метилен из химического стакана переносят в чистую делительную воронку, прибавляют 100 куб. см дистиллированной воды, 10 куб. см 0,1%-ного раствора перманганата калия и повторяют процедуру промывки. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний слой хлористого метилена собирают в концентратор объемом 250 куб. см через слой безводного сульфата натрия. Верхний водный слой отбрасывают. Осушитель обмывают 10 куб. см хлористого метилена, объединяют смыв с основным экстрактом и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

9.5.3. Очистка экстракта на колонках с Флоризилом и на концентрирующих патронах Диапак С16.

Сухой остаток, полученный по п. 9.5.2, растворяют в 0,5 куб. см этилацетата, добавляют 5 куб. см гексана и очищают на колонках с Флоризилом, как указано в п. 9.3.3. После очистки элюат выпаривают досуха, растворяют в 1 куб. см ацетонитрила, добавляют 9 куб. см воды и очищают на патроне Диапак С16, как указано в п. 9.1.3. После очистки элюат выпаривают досуха, растворяют в 5 куб. см ацетонитрила и хроматографируют.

После хроматографирования каждой пробы следует промывать колонку не менее 12 минут.

Хроматограф "Waters" или другой с аналогичными характеристиками с ультрафиолетовым детектором с изменяемой длиной волны.

Колонка стальная Symmetry Shield RP18, 4,6 мм х 25 см, зернением 5 мкм.

Предколонка стальная Symmetry C18, 3,9 мм х 2 см, зернением 5 мкм.

Температура колонки: 25 °С.

Подвижная фаза: ацетонитрил - 3,1 мМ ортофосфорная кислота в соотношении 65:35.

Длина волны 245 нм.

Время удерживания Фамоксадона 10,6 - 11,07 мин.

Чувствительность 0,003 ед. оптической плотности на шкалу.

Объем вводимой пробы 20 куб. мм.

Линейный диапазон детектирования сохраняется в пределах 2 - 20 нг.

Содержание Фамоксадона рассчитывают по формуле:

где:

Х - содержание Фамоксадона в пробе, мг/кг или мг/куб. дм;

Sст - высота (площадь) пика стандарта, мм;

Sпр - высота (площадь) пика образца, мм;

А - концентрация стандартного раствора, мкг/куб. см;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;

m - масса анализируемого образца, г (куб. см);

Р - содержание Фамоксадона в аналитическом стандарте, %.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предел повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

В случае если содержание компонента меньше нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе менее 0,05 мг/кг" <*>.

--------------------------------

<*> 0,05 мг/кг - предел обнаружения.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости

Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К.А. Тимирязева. Учебно-научный консультационный центр "Агроэкология пестицидов и агрохимикатов".