"МУК 4.1.2166-07. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств ипродиона в огурцах и томатах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 15.02.2007)

1. Методические указания подготовлены Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана при участии специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко.

4. Введены впервые.

Настоящие Методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации ипродиона в огурцах и томатах в диапазоне 0,02 - 0,2 мг/кг.

Ипродион - действующее вещество фунгицида Ровраль, СП (500 г/кг), фирма-производитель Байер Кроп Сайенс (Германия).

3-(3,5-дихлорфенил)-N-изопропил-2,4-диоксоимидазолидин-1-карбоксамид (ИЮПАК).

3-(3,5-дихлорфенил)-N-(1-метилэтил)-2,4-диоксо-1-имидазолидинкарбоксамид (С.А.).

Структурная формула (не приводится).

Инсектицид нетоксичен для птиц, пчел, дафний, земляных червей, почвенных микроорганизмов.

Гигиенические нормативы для ипродиона в России: ОДК в почве - 0,15 мг/кг; ПДК в воде - 0,01 мг/куб. дм; ОБУВ в воздухе рабочей зоны - 1,0 мг/куб. м; МДУ для винограда - 0,4 мг/кг; для картофеля, огурцов, томатов, подсолнечника (семена и масло), моркови и земляники - не допускается в пределах чувствительности метода контроля.

Область применения препарата

Ипродион является контактным фунгицидом с защитным и искореняющим действием. Ингибирует прорастание спор и рост грибного мицелия. Вещество проявляет высокую эффективность против возбудителей септориоза, церкоспороза, альтернариоза, фузариоза, фомоза, белой и серой гнилей всходов, мучнистой росы, фомопсиса на овощных, масличных и цветочных культурах, виноградниках.

Проходит регистрационные испытания в России и странах СНГ под торговым названием Ровраль, СП (500 г/кг) в качестве средства борьбы с возбудителями фитофтороза, пероноспороза и альтернариоза на посадках огурцов и томатов защищенного грунта путем обработки вегетирующих растений.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в таблице 2.

Методика основана на определении ипродиона с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовым детектором. Контроль ипродиона в образцах плодов огурца и томата осуществляется по содержанию вещества после экстракции его из растительного материала водным ацетоном, очистки экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей, а также на колонке с силикагелем и концентрирующем патроне Диапак С8.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичной или более высокой квалификацией.

Допускается применение другого оборудования с аналогичными или лучшими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими веществами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостной хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на жидкостном хроматографе.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией "лаборант", имеющего опыт работы в химической лаборатории.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 + 5) °С и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление растворов, подвижной фазы для ВЭЖХ, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики, подготовка колонки с силикагелем и концентрирующего патрона Диапак С8.

7.1.1. Очистка ацетонитрила

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора не менее 1 часа, после чего перегоняют. Непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия.

7.1.2. Очистка н-гексана

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до прекращения окрашивания ее в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над поташом.

7.1.3. Очистка этилацетата

Этилацетат промывают последовательно 5%-ным водным раствором карбоната натрия, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над безводным карбонатом калия и перегоняют.

7.1.4. Очистка силикагеля

Силикагель 60 (0,063 - 0,20 мм) для колоночной хроматографии встряхивают с двойным объемом очищенного ацетона и затем фильтруют на воронке Бюхнера через бумажный фильтр. Силикагель на фильтре промывают 1,5 объемом ацетона и затем высушивают при температуре 130 °С в течение 5 часов.

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 0,34 куб. см 85%-ной орто-фосфорной кислоты, доводят водой до метки, тщательно перемешивают.

Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 8 - 10 мм уплотняют тампоном из стекловаты, медленно выливают в колонку (при открытом кране) суспензию 5 г силикагеля I степени активности в 20 куб. см гексана. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку промывают 20 куб. см смеси гексан - этилацетат (1:9 по объему) и 30 куб. см смеси гексан - этилацетат (9:1 по объему) со скоростью 1 - 2 капли в сек., после чего она готова к работе.

Концентрирующий патрон Диапак С8 промывают последовательно с помощью медицинского шприца 7 куб. см ацетонитрила и 7 куб. см смеси ацетонитрил - вода (2:8) со скоростью 5 куб. см/мин.

В круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 0,1 куб. см градуировочного раствора N 1 ипродиона с концентрацией 10 мкг/куб. см в ацетонитриле (п. 7.7.2), раствор упаривают досуха, остаток растворяют в 3 куб. см смеси гексан - этилацетат (9:1 по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на колонку, подготовленную по п. 7.3. Промывают колонку 50 куб. см смеси гексан - этилацетат (9:1 по объему) со скоростью 1 - 2 капли в сек., элюат отбрасывают. Затем колонку промывают 50 куб. см смеси гексан - этилацетат (8:2 по объему). Фракционно (по 10 куб. см) отбирают элюат, упаривают, остатки растворяют в 1,0 куб. см ацетонитрила, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., вносят 1,5 куб. см подвижной фазы, подготовленной по п. 7.5, перемешивают и анализируют на содержание ипродиона по п. 9.5.

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 650 куб. см ацетонитрила, 350 куб. см 0,005 М раствора орто-фосфорной кислоты, перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр.

Промывают колонку подвижной фазой (приготовленной по п. 7.5) при скорости подачи растворителя 1 куб. см/мин. не менее 2-х часов до установления стабильной базовой линии.

7.7.1. Исходный раствор ипродиона для градуировки (концентрация 100 мкг/куб. см)

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 0,010 г ипродиона, растворяют в 40 - 50 куб. см ацетонитрила, доводят ацетонитрилом до метки, тщательно перемешивают.

Раствор хранят в морозильной камере при температуре не выше -18 °С в течение 3-х месяцев.

7.7.2. Раствор ипродиона N 1 для градуировки (концентрация 10 мкг/куб. см)

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 10 куб. см исходного раствора ипродиона с концентрацией 100 мкг/куб. см (п. 7.7.1), разбавляют до метки. Этот раствор используют для приготовления рабочих градуировочных растворов N 2 - 5, а также для приготовления проб огурцов и томатов с внесением при оценке полноты извлечения ипродиона из исследуемых образцов.

Градуировочный раствор N 1 хранят в морозильной камере при температуре не выше -18 °С в течение месяца.

7.7.3. Рабочие растворы N 2 - 5 ипродиона для градуировки (концентрация 0,05 - 0,5 мкг/куб. см)

В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают 0,5; 1,0; 2,5 и 5,0 куб. см градуировочного раствора N 1 ипродиона с концентрацией 10 мкг/куб. см (п. 7.7.2), доводят до метки подвижной фазой, приготовленной по п. 7.5, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 2 - 5 с концентрацией ипродиона 0,05; 0,1; 0,25 и 0,5 мкг/куб. см соответственно.

Растворы готовят непосредственно перед использованием.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость высоты пика (мм) от концентрации ипродиона в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4-м растворам для градуировки.

В инжектор хроматографа вводят по 20 куб. мм каждого градуировочного раствора (п. 7.7.3) и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.5. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79) и правилами, определенными ГОСТами 1725-85 "Томаты свежие" и 1726-85 "Огурцы свежие. Технические условия".

Пробы огурцов и томатов хранят в стеклянной посуде в холодильнике при температуре 4 °С не более 2-х дней; при длительном хранении пробы замораживают и хранят в морозильной камере при температуре -18 °С. Перед анализом плоды измельчают.

9.1.1. Плоды. Навеску (25 г) измельченного растительного материала помещают в стакан гомогенизатора вместимостью 500 куб. см, приливают 100 куб. см 50%-ного водного ацетона и гомогенизируют 5 минут при 8000 об./мин. Гомогенат фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу вместимостью 250 куб. см. Осадок на фильтре промывают 50 куб. см 50%-ного водного ацетона. Экстракт и промывную жидкость переносят в химический стакан, перемешивают, измеряют объем раствора и 1/5 его часть (эквивалентна 5 г образца) переносят в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. Дальнейшую очистку экстракта проводят по п. 9.2.

Экстракт плодов, полученный по п. 9.1 и помещенный в круглодонную колбу, упаривают на ротационном вакуумном испарителе до водного остатка (10 - 12 куб. см) при температуре 40 °С. К водному остатку приливают 15 куб. см насыщенного раствора хлорида натрия, перемешивают и переносят в делительную воронку вместимостью 100 куб. см. В воронку вносят 30 куб. см гексана, интенсивно встряхивают в течение 2-х минут. После разделения фаз верхний органический слой фильтруют через слой безводного сульфата натрия в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. Операцию экстракции водной фазы повторяют еще дважды, используя 30 и 20 куб. см гексана. Объединенную органическую фазу, пропущенную через слой безводного сульфата натрия, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре 30 °С и подвергают дополнительной очистке на колонке с силикагелем и концентрирующем патроне Диапак С8 по п. п. 9.3 и 9.4.

Остаток в круглодонной колбе, полученный по п. 9.2, растворяют в 3,0 куб. см смеси гексан - этилацетат (9:1 по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на колонку, подготовленную по п. 7.3. Колбу обмывают 5 куб. см смеси гексан - этилацетат (9:1 по объему), которые также наносят на колонку. Колонку промывают 45 куб. см смеси гексан - этилацетат (9:1 по объему) со скоростью 1 - 2 капли в сек., элюат отбрасывают. Ипродион элюируют с колонки 45 куб. см смеси гексан - этилацетат (8:2 по объему), отбрасывая первые 20 куб. см элюата и собирая последующие 25 куб. см элюата непосредственно в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. Раствор упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре 40 °С и остаток подвергают дополнительной очистке на концентрирующем патроне Диапак С8 по п. 9.4.

Сухой остаток в круглодонной колбе, полученный по п. 9.3, растворяют в 0,6 куб. см ацетонитрила, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., добавляют 2,4 куб. см деионизованной воды, перемешивают, вновь помещают в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор вносят с помощью медицинского шприца на концентрирующий патрон Диапак С8, подготовленный по п. 7.3, со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Колбу обмывают 2 куб. см ацетонитрил - вода (2:8 по объему), которые также вносят на патрон. После нанесения пробы патрон промывают 2 куб. см смеси ацетонитрил - вода (5:5 по объему), элюат отбрасывают. Ипродион элюируют с патрона 4 куб. см смеси ацетонитрил - 0,005 М орто-фосфорная кислота (65:35 по объему), собирая элюат непосредственно в круглодонную колбу вместимостью 50 куб. см. Раствор упаривают досуха при температуре 40 °С. Остаток в колбе растворяют в 1 куб. см ацетонитрила, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин, вносят 1 куб. см подвижной фазы, подготовленной по п. 7.5, перемешивают и анализируют на содержание ипродиона по п. 9.5.

Жидкостный хроматограф с ультрафиолетовым детектором (фирма Knauer, Германия).

Колонка стальная длиной 15 см, внутренним диаметром 4 мм, содержащая в качестве неподвижной фазы Диасфер 110-С18 зернением 5 мкм.

Температура колонки: комнатная.

Подвижная фаза: ацетонитрил - 0,005 М орто-фосфорная кислота (65:35 по объему).

Скорость потока элюента: 0,8 куб. см/мин.

Рабочая длина волны: 225 нм.

Чувствительность: 0,005 ед. абсорбции на шкалу.

Объем вводимой пробы: 20 куб. мм.

Время удерживания ипродиона: около 6 минут.

Линейный диапазон детектирования: 1 - 10 нг.

Альтернативная неподвижная фаза: Диасорб 130-С8 Т (6 мкм).

Время удерживания ипродиона: около 5 мин. 40 сек.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор с концентрацией 0,5 мкг/куб. см, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

Содержание ипродиона рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

дельта - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, таблица 1), %.

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе "менее нижней границы определения" менее 0,02 мг/кг <*> для плодов огурца и томата".

--------------------------------

<*> 0,02 мг/кг - предел обнаружения для плодов огурца и томата.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

ВНИИ фитопатологии.