"МУК 4.1.2294-07. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств этилфенацина в воде методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 10.10.2007)

1. Разработаны Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана (Т.В. Юдина, Н.Е. Федорова, В.Н. Волкова).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол N 2 от 21.06.2007).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 10 октября 2007 г.

4. Введены в действие с 25 декабря 2007 г.

5. Введены впервые.

Настоящие Методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения в воде массовой концентрации этилфенацина в диапазоне 0,0002 - 0,004 мг/куб. дм.

2-(альфа-фенил-альфа-(4-этилфенил)-ацетил)-индан-1,3-дион (IUPAC)

Структурная формула - не приводится.

Этилфенацин - ротентицид класса индандионов, обладающий антикоагулянтной активностью, рекомендуется для борьбы с грызунами в открытом грунте (осень, зима, весна) на зимующих культурах (зерновые, пастбищные травы, древесные, кустарниковые насаждения и др.), в защищенном грунте на всех культурах независимо от сезона. Применяется в виде приманки.

ОДУ этилфенацина в воде водоемов - 0,0008 мг/куб. дм.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 2.

Методика основана на определении вещества с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовым детектором после экстракции из анализируемой пробы воды дихлорметаном и последующей очистки экстракта на патроне для твердофазной экстракции Sep-Pak Silica.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на жидкостном хроматографе.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией "лаборант", имеющего опыт работы в химической лаборатории.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ, кондиционирование хроматографической колонки, приготовление растворов для градуировки и внесения, установление градуировочной характеристики, подготовка патронов для твердофазной экстракции, проверка хроматографического поведения вещества на них, отбор проб.

7.1.1. Очистка ацетонитрила

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора не менее 1 часа, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия.

7.1.2. Очистка этилацетата

Этилацетат промывают последовательно 5% водным раствором карбоната натрия, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над безводным карбонатом калия и перегоняют или подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретических тарелок не менее 50.

7.1.3. Очистка н-Гексана

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до тех пор, пока она не перестанет окрашиваться в желтый цвет, водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над поташом.

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 870 куб. см ацетонитрила, 130 куб. см бидистиллированной или деионизованной воды и 1 куб. см ортофосфорной кислоты, перемешивают, фильтруют и дегазируют.

Промывают колонку подвижной фазой (приготовленной по п. 7.2) при скорости подачи растворителя 1,0 куб. см/мин. до установления стабильной базовой линии.

7.4.1. Исходный раствор этилфенацина для градуировки (концентрация 100 мкг/куб. см)

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см вносят 0,01 г этилфенацина, добавляют 50 - 70 куб. см ацетонитрила, перемешивают, доводят ацетонитрилом до метки, вновь перемешивают. Раствор хранится в холодильнике в течение месяца.

Растворы N 1 - 5 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходного раствора для градуировки.

7.4.2. Раствор N 1 этилфенацина для градуировки и внесения (концентрация 10 мкг/куб. см)

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 10 куб. см исходного раствора этилфенацина с концентрацией 100 мкг/куб. см (п. 7.4.1), разбавляют ацетонитрилом до метки, перемешивают. Раствор хранится в холодильнике в течение месяца.

Раствор используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения действующего вещества методом "внесено-найдено", а также контроле качества результатов измерений методом добавок.

7.4.3. Рабочие растворы N 2 - 5 этилфенацина для градуировки (концентрация 0,05 - 1,0 мкг/куб. см)

В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают по 0,5; 1,0; 2,5 и 10,0 куб. см градуировочного раствора N 1 с концентрацией 10 мкг/куб. см (п. 7.4.2), доводят до метки подвижной фазой, приготовленной по п. 7.2, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 2 - 5 с концентрацией этилфенацина 0,05; 0,1; 0,25 и 1,0 мкг/куб. см соответственно.

Растворы хранятся в холодильнике в течение недели.

Градуировочную характеристику, выражающую линейную (с угловым коэффициентом) зависимость суммы площадей 2 пиков орто- и параизомеров этилфенацина (мкВ х с) от концентрации вещества в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки N 2 - 5.

В инжектор хроматографа вводят по 20 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 7.5.1. Осуществляют не менее 3 параллельных измерений. Устанавливают площади пиков изомеров действующего вещества, рассчитывают сумму площадей орто- и параизомеров этилфенацина.

Градуировочный график проверяют ежедневно по анализу 2 растворов для градуировки различной концентрации. Если значения площадей отличаются более чем на 10% от данных, заложенных в градуировочную характеристику, ее строят заново, используя свежеприготовленные рабочие растворы для градуировки.

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 50 - 70 куб. см этилацетата, вносят 2 куб. см ледяной уксусной кислоты, доводят до метки этилацетатом, тщательно перемешивают.

Патрон Sep-Pak Silica устанавливают на аллонж с прямым отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом Льюера объемом не менее 10 куб. см, используемый в качестве емкости для элюента.

Концентрирующий патрон промывают последовательно 5 куб. см этилацетата, затем 5 куб. см смеси гексан-этилацетат (1:1, по объему). Процедуру проводят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 куб. см/мин., при этом нельзя допускать высыхания поверхности патрона.

Примечание: В отсутствии специального аллонжа, жидкость продавливают через патрон с помощью шприца, скорость продавливания раствора не должна превышать 1 - 2 капли в сек.

В круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 0,2 куб. см градуировочного раствора N 1 этилфенацина (п. 7.4.2), растворитель упаривают досуха при температуре не выше 35 °C, остаток растворяют в 2 куб. см этилацетата, помещают на 30 с в ультразвуковую баню. Затем в колбу добавляют 2 куб. см гексана, смесь тщательно перемешивают и вносят на концентрирующий патрон, подготовленный по п. 7.7. Колбу обмывают 5 куб. см смеси гексан-этилацетат (1:1, по объему) и также вносят на патрон. Патрон дополнительно промывают 15 куб. см смеси гексан-этилацетат (1:1, по объему), 20 куб. см смеси этих же растворителей в объемном соотношении 3:7, затем 20 куб. см этилацетата. Скорость прохождения раствора через патрон не должна превышать 1 - 2 капли в сек. Элюат отбрасывают.

Этилфенацин элюируют с патрона 40 куб. см 1% уксусной кислоты в этилацетате (п. 7.6), собирая 5 порций элюата по 5 куб. см каждая непосредственно в круглодонные колбы. Растворы в колбах упаривают досуха при температуре не выше 35 °C. Остаток в каждой колбе растворяют в 2 куб. см подвижной фазы (приготовленной по п. 7.2) и анализируют содержание этилфенацина по п. 9.3. Фракции, содержащие этилфенацин, объединяют и вновь анализируют. Рассчитывают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с патрона и необходимый для очистки объем элюента.

Примечание: Проверку хроматографического поведения этилфенацина следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии патронов и растворителей.

Отбор проб производится в соответствии с ГОСТ Р 51592-2000 "Вода. Общие требования к отбору проб", "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79).

Пробы воды анализируют в день отбора, при необходимости хранят в холодильнике при температуре 4 - 6 °C в течение 10 недель. Для длительного хранения пробы замораживают и хранят в полиэтиленовой таре в морозильной камере при температуре -18 °C.

Перед анализом образцы воды фильтруют через неплотный бумажный фильтр.

Образец анализируемой воды объемом 500 куб. см помещают в делительную воронку вместимостью 1000 куб. см, добавляют 75 куб. см хлористого метилена, интенсивно встряхивают делительную воронку в течение 2 мин. После полного разделения фаз нижний органический слой переносят в круглодонную колбу вместимостью 250 куб. см, фильтруя его через слой 2 см безводного сульфата натрия, помещенный в конусную химическую воронку диаметром 60 мм, снабженную бумажным фильтром "красная лента". Операцию экстракции водной фазы повторяют еще дважды порциями этилацетата по 50 куб. см. Отстоявшийся слой хлористого метилена (нижняя фаза) фильтруют в колбу с ранее полученным экстрактом.

Объединенный экстракт упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °C, подвергают очистке в соответствии с п. 9.2.

Сухой остаток в колбе, полученный по п. 9.1, растворяют в 2 куб. см этилацетата, помещают на 30 с в ультразвуковую баню. Затем в колбу добавляют 2 куб. см гексана, смесь тщательно перемешивают и вносят на концентрирующий патрон Sep-Pak Silica, подготовленный по п. 7.7. Колбу обмывают 5 куб. см смеси гексан-этилацетат (1:1, по объему) и также вносят на патрон. Патрон дополнительно промывают 15 куб. см смеси гексан-этилацетат (1:1, по объему), 20 куб. см смеси этих же растворителей в объемном соотношении 3:7, затем 20 куб. см этилацетата. Скорость прохождения раствора через патрон не должна превышать 1 - 2 капли в сек. Элюат отбрасывают.

Этилфенацин элюируют с патрона 35 куб. см 1% уксусной кислоты в этилацетате (п. 7.6), собирая элюат непосредственно в круглодонную колбу. Раствор упаривают досуха при температуре не выше 35 °C. Остаток в колбе растворяют в 2 куб. см подвижной фазы (приготовленной по п. 7.2) и анализируют содержание этилфенацина по п. 9.3.

Измерения выполняют при следующих режимных параметрах.

Жидкостный хроматограф "Breeze" с ультрафиолетовым детектором (фирма Waters, США).

Хроматографическая колонка стальная длиной 250 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, содержащая Symmetry(R) C18, зернением 5 мкм.

Температура колонки: комнатная.

Подвижная фаза: ацетонитрил-вода-ортофосфорная кислота (87:13:0,1, по объему).

Скорость потока элюента: 1,0 куб. см/мин.

Рабочая длина волны: 312 нм.

Чувствительность: 0,005 ед. абсорбции на шкалу.

Объем вводимой пробы: 20 куб. мм.

Ориентировочное время выхода этилфенацина:

ортоизомер: 8,18 - 8,24 мин.;

параизомер: 9,25 - 9,30 мин.

Линейный диапазон детектирования: 1 - 20 нг.

Образцы, дающие пики, большие, чем градуировочный раствор этилфенацина с концентрацией 1 мкг/куб. см, разбавляют (не более чем в 50 раз) подвижной фазой для ВЭЖХ (подготовленной по п. 7.2).

Содержание изопропилфенацина в пробе рассчитывают по формуле:

где:

X - содержание этилфенацина в пробе, мг/куб. дм;

A - концентрация этилфенацина, найденная по градуировочному графику, в соответствии с величиной суммы площадей хроматографических пиков орто- и параизомеров, мкг/куб. см;

W - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;

V - объем анализируемого образца воды, куб. см.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

где дельта - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе менее 0,0002 мг/куб. дм" <*>.

--------------------------------

<*> 0,0002 мг/куб. дм - предел обнаружения.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R)