"МУК 4.1.2140-06. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методические указания по определению остаточных количеств бромадиолона в воде методом высокоэффективной жидкостной хроматографии"
(утв. Роспотребнадзором 04.12.2006)

1. Подготовлены Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана при участии специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко.

4. Введены впервые.

Настоящие Методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации бромадиолона в воде в диапазоне 0,0005 - 0,01 мг/куб. дм.

Бромадиолон - действующее вещество препарата БРОМ-БД, концентрат (2,5 г/кг); фирма ООО "Валбрента Кемикалс".

3-[3-(4'-Бромбифенил-4-ил)-3-гидрокси-1-фенилпропил]-4-гидроксикумарин (IUPAC).

Структурная формула (не приводится).

Область применения препарата

Бромадиолон - родентицид антикоагулянтного типа класса кумаринов, предназначенный для приготовления отравленных пищевых приманок для борьбы с вредными полевыми и домашними грызунами внутри жилых и нежилых помещений. Является антикоагулянтом второго поколения с отсроченным сроком действия.

Выпускается в виде 0,25%-ного концентрата.

Рекомендуемая ПДК в воде водоемов 0,001 мг/куб. дм.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в таблице 2.

Метод основан на определении вещества с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовым детектором. Для концентрирования и очистки проб воды использованы патроны для твердофазной экстракции Sep Pak С18.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичной или более высокой квалификацией.

Допускается применение другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостной хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на жидкостном хроматографе.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией "лаборант", имеющего опыт работы в химической лаборатории.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °С и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка метанола перегонкой с дефлегматором (при необходимости), приготовление раствора орто-фосфорной кислоты, градуировочных растворов, подвижной фазы для ВЭЖХ, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики, подготовка концентрирующих патронов Sep Pak С18.

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 1,36 куб. см 85%-ной орто-фосфорной кислоты, доводят водой до метки, тщательно перемешивают.

Концентрирующий патрон промывают с помощью медицинского шприца 2 куб. см метанола со скоростью прохождения растворителя через патрон 1 - 2 капли в сек., затем 5 куб. см деионизованной воды. Патрон готовят непосредственно перед использованием для концентрирования образца.

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 170 куб. см бидистиллированной или деионизированной воды, 1,0 куб. см орто-фосфорной кислоты, 830 куб. см метанола, перемешивают, фильтруют и дегазируют.

Промывают колонку подвижной фазой (приготовленной по п. 7.3) при скорости подачи растворителя 1,0 куб. см/мин. до установления стабильной базовой линии.

7.5.1. Исходный раствор бромадиолона для градуировки (концентрация 100 мкг/куб. см)

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см вносят 0,0100 г бромадиолона, добавляют 50 - 70 куб. см метанола, помещают на ультразвуковую баню на 1 мин. для растворения, доводят метанолом до метки, тщательно перемешивают. Раствор хранится в холодильнике в течение 3-х месяцев.

Растворы N 1 - 6 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходного раствора для градуировки.

7.5.2. Раствор N 1 бромадиолона для градуировки и внесения (концентрация 5 мкг/куб. см)

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 5 куб. см исходного градуировочного раствора бромадиолона с концентрацией 100 мкг/куб. см (п. 7.5.1), разбавляют метанолом до метки, перемешивают. Раствор хранится в холодильнике в течение месяца.

Раствор используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения действующего вещества методом "внесено-найдено", а также контроле качества результатов измерений методом добавок.

7.5.3. Рабочие растворы N 2 - 6 бромадиолона для градуировки (концентрация 0,025 - 0,5 мкг/куб. см)

В 5 мерных колб вместимостью 100 куб. см помещают по 0,5; 1,0; 2,0; 5,0 и 10,0 куб. см градуировочного раствора N 1 с концентрацией 5 мкг/куб. см (п. 7.5.2), доводят до метки подвижной фазой для ВЭЖХ (подготовленной по п. 7.3), тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 2 - 5 с концентрацией бромадиолона 0,025; 0,05; 0,1; 0,25 и 0,5 мкг/куб. см соответственно.

Растворы хранятся в холодильнике в течение 2-х недель.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость суммы площадей пиков диастереоизомеров бромадиолона (отн. единицы) от концентрации вещества в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 5-ти растворам для градуировки N 2 - 6.

В инжектор хроматографа вводят по 20 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.2. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений. Устанавливают сумму площадей пиков диастереоизомеров действующего вещества.

Градуировочный график проверяют ежедневно по анализу 2-х растворов для градуировки различной концентрации. Если значения суммы площадей отличаются более чем на 11% от данных, заложенных в градуировочную характеристику, ее строят заново, используя свежеприготовленные рабочие растворы для градуировки.

Отбор проб производится в соответствии с ГОСТ Р 51592-2000 "Вода. Общие требования к отбору проб", "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.1979).

Пробы воды анализируют в день отбора, при необходимости хранят в холодильнике при температуре 4 - 6 °С в течение 3-х недель. Для длительного хранения пробы замораживают и хранят в полиэтиленовой таре в морозильной камере при температуре -18 °С.

Перед анализом образцы воды фильтруют через неплотный бумажный фильтр.

Образец отфильтрованной воды объемом 200 куб. см, помещенный в химический стакан вместимостью 250 - 300 куб. см, вносят с помощью медицинского шприца на концентрирующий патрон Sep Pak С18, подготовленный по п. 7.2, со скоростью пропускания раствора 1 - 2 капли в сек. После завершения концентрирования пробы патрон промывают последовательно тремя порциями по 5 куб. см смеси вода - метанол в следующем объемном соотношении 9:1, затем 7:3 и 1:1, далее 5 куб. см смеси метанол - 0,02 М - орто-фосфорная кислота (1:1, по объему), элюаты отбрасывают. Вещество элюируют с патрона 4 куб. см подвижной фазы, приготовленной по п. 7.3, собирая элюат в градуированную пробирку с пришлифованной пробкой, перемешивают и анализируют на содержание бромадиолона по п. 9.2.

Измерения выполняют при следующих режимных параметрах:

Жидкостной хроматограф "Breeze" с ультрафиолетовым детектором (фирма Waters, США)

Хроматографическая колонка стальная длиной 150 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, содержащая Symmetry(R) С18, зернением 5 мкм

Температура колонки: комнатная

Подвижная фаза: метанол - вода - орто-фосфорная кислота (83:17:0,1, по объему)

Скорость потока элюента: 1,0 куб. см/мин.

Рабочая длина волны: 280 нм

Чувствительность: 0,005 ед. абсорбции на шкалу

Объем вводимой пробы: 20 куб. мм

Ориентировочное время выхода бромадиолона (2 диастереоизомера):

7,2 мин.;

7,56 мин. (основной пик).

Образцы, дающие пики большие, чем градуировочный раствор бромадиолона с концентрацией 0,5 мкг/куб. см, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ (подготовленной по п. 7.3).

Содержание бромадиолона в пробе воды (Х, мг/куб. дм) рассчитывают по формуле:

где:

А - концентрация бромадиолона, найденная по градуировочному графику в соответствии с суммой площадей пиков диастереоизомеров, мкг/куб. см;

V - объем раствора, подготовленного для хроматографирования, куб. см;

W - объем анализируемого образца воды, куб. см.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе менее 0,0005 мг/куб. дм" <*>.

--------------------------------

<*> 0,0005 мг/куб. дм - предел обнаружения.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность (прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана.