"МУК 4.1.2213-07. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств феназахина в ягодах винограда и виноградном соке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 25.05.2007)

1. Разработаны Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана.

2. Рекомендованы к утверждению комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол N 1 от 29.03.2007).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 25 мая 2007 г.

4. Введены впервые.

Настоящие Методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации феназахина в ягодах винограда и виноградном соке в диапазоне 0,005 - 0,05 мг/кг.

Феназахин - действующее вещество препарата ДЕМИТАН, КС (200 г/л), фирма производитель "Кромптон", Англия.

4-[2-(4-трет-бутилфенил)этокси]хиназолин (IUPAC).

Структурная формула (не приводится).

Область применения препарата

Феназахин рекомендуется к применению в качестве акарицида против паутинных и галлообразующих клещей на яблоне, груше и винограде в личных подсобных хозяйствах.

МДУ феназахина в винограде 0,01 мг/кг.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения веществ, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в таблице 2.

Методика основана на определении вещества с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовым детектором после экстракции из анализируемой пробы ягод винограда и виноградного сока - ацетоном, очистки экстракта перераспределением между двумя несмешивающимися фазами и на колонке с флорисилом.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки. Нижний предел измерения в хроматографируемом объеме пробы: 0,25 нг.

В предлагаемых условиях определения метод специфичен в присутствии компонентов препаративной формы, включая манкоцеб.

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Допускается применение хроматографических колонок и другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостной хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на жидкостном хроматографе.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией "лаборант", имеющего опыт работы в химической лаборатории.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °С и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление раствора хлористого натрия, градуировочных растворов, растворов внесения, подвижной фазы для ВЭЖХ, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики, подготовка колонки с оксидом алюминия для очистки экстракта, проверка хроматографического поведения вещества на колонке.

7.1.1. Ацетонитрил

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора не менее 1 часа, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия.

7.1.2. н-Гексан

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты, до тех пор, пока она не перестанет окрашиваться в желтый цвет, водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над поташом.

7.1.3. Этилацетат

Этилацетат промывают последовательно 5%-ным водным раствором карбоната натрия, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над безводным карбонатом калия и перегоняют или подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретических тарелок не менее 50.

В мерную колбу вместимостью 500 куб. см помещают 25 г хлористого натрия, растворяют в 300 - 350 куб. см дистиллированной воды, доводя водой до метки, тщательно перемешивают.

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 900 куб. см ацетонитрила, добавляют 100 куб. см бидистиллированной воды, перемешивают, фильтруют и дегазируют.

Промывают колонку подвижной фазой (приготовленной по п. 7.3) при скорости подачи растворителя 1 куб. см/мин. не менее 2-х часов до установления стабильной базовой линии.

7.5.1. Исходный раствор феназахина в ацетонитриле для градуировки (концентрация 100 мкг/куб. см). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 0,01 г феназахина, растворяют в 50 - 70 куб. см ацетонитрила, доводят до метки этим же растворителем, тщательно перемешивают. Раствор хранится в морозильной камере в течение месяца.

Рабочие градуировочные растворы феназахина готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходного раствора.

7.5.2. Раствор N 1 феназахина для градуировки (концентрация 10 мкг/куб. см). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 10 куб. см исходного раствора феназахина с концентрацией 100 мкг/куб. см (п. 7.5.1), разбавляют ацетонитрилом до метки. Раствор хранится в холодильнике в течение месяца.

7.5.3. Рабочие растворы N 2 - 5 для градуировки и внесения (концентрация 0,1 - 1,0 мкг/куб. см). В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают по 1,0; 2,0; 5,0 и 10,0 куб. см раствора N 1 с концентрацией 10 мкг/куб. см (п. 7.5.2), доводят до метки подвижной фазой, приготовленной по п. 7.3, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 2 - 5 с концентрацией феназахина 0,1; 0,2; 0,5 и 1,0 мкг/куб. см соответственно. Растворы хранятся в холодильнике в течение 10-ти дней.

Эти растворы используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения феназахина из исследуемых образцов методом "внесено-найдено".

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (мВ х сек.) от концентрации феназахина в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4-м растворам для градуировки N 2 - 5.

В инжектор хроматографа вводят 20 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.4. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений.

Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см, внутренним диаметром 8 - 10 мм уплотняют тампоном из стекловаты, помещают в колонку 5 г оксида алюминия (постукивая резиновой грушей о стенки колонки для уплотнения сорбента), пропускают через колонку 15 - 20 куб. см гексана. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1,5 см. Колонка готова к работе.

В круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 0,5 куб. см раствора N 1 для градуировки с концентрацией феназахина 10 мкг/куб. см (п. 7.5.2), растворитель упаривают досуха. Остаток растворяют в 3 куб. см гексана и наносят на колонку, подготовленную по п. 7.7. Колбу обмывают трижды порциями гексана по 3 куб. см, которые также наносят на колонку. Промывают колонку последовательно порциями по 25 куб. см вначале гексаном, затем смесью гексан - этилацетат (9:1, по объему), элюат отбрасывают.

Далее колонку промывают 50 куб. см смеси гексан - этилацетат (7:3, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в сек. Фракционно (по 10 куб. см) отбирают элюат, упаривают, остатки растворяют в 2 куб. см подвижной фазы, подготовленной по п. 7.3, анализируют по п. 9.4.

Фракции, содержащие феназахин, объединяют и вновь анализируют.

Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с колонки и необходимый объем элюента.

Примечание: Проверку хроматографического поведения феназахина следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии сорбентов и растворителей.

Отбор проб производится в соответствии с правилами, определенными ГОСТами 25896-83 "Виноград свежий столовый, ТУ", 28472-90 "Виноград свежий ручной уборки для консервирования. Требования при заготовках и поставках", 26313-84 "Продукты переработки плодов и овощей", "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79).

Отобранные пробы ягод винограда и виноградного сока хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике не более 10-ти дней. Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре -18 °С.

9.1.1. Виноград

Образец измельченных ягод винограда массой 20 г помещают в коническую колбу вместимостью 250 куб. см, вносят 75 куб. см ацетонитрила, гомогенизируют в течение 3-х минут, затем помещают на встряхиватель на 30 мин. Экстракт фильтруют через складчатый бумажный фильтр, сливая способом декантирования в колбу для упаривания вместимостью 250 куб. см. Экстракцию пробы повторяют новой порцией ацетонитрила объемом 50 куб. см, встряхивая 20 мин. Экстракт также фильтруют в колбу для упаривания, концентрируют на ротационном вакуумном испарителе (при температура 40 °С) до водного остатка (около 10 куб. см) и подвергают очистке по п. 9.2.

9.1.2. Виноградный сок

К образцу сока массой 20 г в конической колбе (с пришлифованной пробкой) вместимостью 250 куб. см добавляют 75 куб. см ацетонитрила, интенсивно встряхивают в течение 5 мин., помещают в холодильник (4 °С) на 1 час. Экстракт фильтруют через складчатый бумажный фильтр, сливая способом декантирования в колбу для упаривания вместимостью 250 куб. см. Экстракцию пробы повторяют новой порцией ацетонитрила объемом 50 куб. см, встряхивая 2 мин. и выдерживая в холодильнике (4 °С) 30 мин. Экстракт также фильтруют в колбу для упаривания, концентрируют на ротационном вакуумном испарителе (при температура 35 - 40 °С) до водного остатка (около 10 куб. см) и подвергают очистке по п. 9.2.

Водный остаток, полученный по п. 9.1.1 или 9.1.2, переносят в делительную воронку вместимостью 250 куб. см. Колбу ополаскивают 75 куб. см 5%-ного раствора хлористого натрия, который также переносят в делительную воронку. Вносят в делительную воронку 30 куб. см гексана, интенсивно встряхивают в течение 2-х мин. После полного разделения фаз верхний органический слой отделяют, фильтруют через безводный сульфат натрия, помещенный на бумажном фильтре в конусной воронке, в круглодонную колбу вместимостью 150 куб. см. Операцию экстракции повторяют еще дважды, используя по 20 куб. см гексана. Объединенную органическую фазу, пропущенную через слой сульфата натрия, упаривают до объема 3 - 5 см и подвергают дополнительной очистке на колонке по п. 9.3.

Остаток в круглодонной колбе, полученный после упаривания (п. 9.2), наносят на колонку, подготовленную по п. 7.6. Колбу обмывают трижды порциями гексана по 3 куб. см, которые также наносят на колонку. Промывают колонку последовательно порциями по 25 куб. см вначале гексаном, затем смесью гексан - этилацетат в соотношении 9:1 (по объему), элюат отбрасывают.

Феназахин элюируют с колонки 30 куб. см смеси гексан - этилацетат (7:3, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в сек., собирая элюат в круглодонную колбу. Раствор упаривают досуха при температуре не выше 35 °С, остаток в колбе растворяют в 1 куб. см подвижной фазы, анализируют содержание феназахина по п. 9.4.

Жидкостной хроматограф с ультрафиолетовым детектором (фирмы Waters, США)

Хроматографическая колонка стальная длиной 250 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, содержащая Symmetry С18, зернением 5 мкм

Температура колонки: комнатная

Скорость потока элюента: 1 куб. см/мин.

Рабочая длина волны: 263 нм

Объем вводимой пробы: 20 куб. мм

Чувствительность: 0,003 ед. абсорбции на шкалу

Подвижная фаза: ацетонитрил - вода (9:1, по объему)

Ориентировочное время выхода феназахина: 7,8 - 8,0 мин.

Линейный диапазон детектирования 2 - 20 нг.

Образцы, дающие пики, большие, чем градуировочный раствор с концентрацией 1,0 мкг/куб. см, разбавляют подвижной фазой, приготовленной по п. 7.3, не более чем в 50 раз.

Содержание феназахина в пробе (Х, мг/кг) рассчитывают по формуле:

где:

С - концентрация феназахина, найденная по градуировочному графику в соответствии с величиной площади хроматографического пика, мкг/куб. см;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;

m - масса анализируемого образца, г.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

Результат анализа представляют в виде:

Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание феназахина в пробе менее 0,005 мг/кг"<*>.

--------------------------------

<*> 0,005мг/кг - предел обнаружения.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

ФГУН "Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана" Роспотребнадзор.