"МУК 4.1.2335-08. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств мефеноксама в зерне и соломе зерновых колосовых культур, семенах и масле рапса методом капиллярной газожидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 15.02.2008)

1. Разработаны ГНУ Всероссийским научно-исследовательским институтом фитопатологии.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 6 декабря 2007 г. N 3).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 15 февраля 2008 г.

4. Введены в действие с 10 апреля 2008 г.

5. Введены впервые.

Настоящие методические указания устанавливают метод капиллярной газожидкостной хроматографии для определения массовой концентрации мефеноксама в зерне колосовых культур, семенах и масле рапса в диапазоне 0,05 - 0,5 мг/кг, в соломе зерновых культур в диапазоне 0,1 - 1 мг/кг.

Название вещества по ИСО: Мефеноксам.

Название вещества по ИЮПАК: Метил-N-(метоксиацетил)-N-(2,6-ксилил)-D-аланинат.

Структурная формула (не приводится).

Рекомендуемый гигиенический норматив для мефеноксама в зерне хлебных злаков, семенах и масле рапса - 0,1 мг/кг.

Область применения

Мефеноксам - системный фунгицид защитного и искореняющего действия из класса фениламидов. Ингибирует образование белков в грибах, подавляя синтез рибосомальной РНК. Высокоэффективен против возбудителей фитофтороза картофеля и томатов, мильдью винограда, ложной мучнистой росы и корнееда овощных культур, сахарной свеклы и подсолнечника, увядания растений кукурузы.

Применяется в России в качестве протравителя семян сахарной свеклы и подсолнечника с нормой расхода 0,17 - 1,0 кг д.в./т. Помимо этого, мефеноксам в составе смесевых препаратов с фунгицидами защитного действия используется для двух-трехкратной обработки посевов овощных культур, картофеля и винограда в течение вегетационного периода с нормой расхода 0,1 - 0,2 кг д.в./га.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в таблице 2.

Методика основана на определении вещества с помощью капиллярной газожидкостной хроматографии (ГЖХ) с термоионным детектором (ТИД). Контроль мефеноксама в матрицах осуществляется по содержанию вещества после экстракции его из зерна и соломы ацетоном, а из семян и масла рапса ацетонитрилом, очистки экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей, а также на колонке с оксидом алюминия и концентрирующем патроне Диапак-диол.

Идентификация проводится по времени удерживания пика вещества, количественное определение - методом абсолютной калибровки.

В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Избирательность обеспечивается путем подбора капиллярной колонки и условий программирования температуры колонки.

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичной или более высокой квалификацией.

Допускается применение другого оборудования с аналогичными или лучшими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на газовом хроматографе.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией "лаборант", имеющего опыт работы в химической лаборатории.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 + 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики, подготовка колонки с оксидом алюминия и концентрирующих патронов Диапак-диол.

7.1.1. Очистка н-гексана.

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до прекращения окрашивания последней в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над поташом.

7.1.2. Очистка этилацетата.

Этилацетат промывают последовательно 5%-ным водным раствором карбоната натрия, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над безводным карбонатом калия и перегоняют.

7.1.3. Очистка ацетона.

7.1.4. Очистка диэтилового эфира.

Растворитель предварительно встряхивают со свежеприготовленным раствором железного купороса, а затем последовательно промывают 0,5%-ным раствором перманганата калия, 5%-ным раствором гидроксида натрия и водой, после чего сушат над хлористым кальцием и перегоняют.

Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 8 - 10 мм уплотняют тампоном из стекловаты, медленно выливают в колонку (при открытом кране) суспензию 10 г оксида алюминия V степени активности в 15 куб. см гексана (оксид алюминия V степени активности по Брокману получают добавлением 15% воды к оксиду алюминия I степени активности). Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку промывают 15 куб. см гексана со скоростью 1 - 2 капли в сек., после чего она готова к работе.

Концентрирующий патрон Диапак-диол промывают последовательно с помощью медицинского шприца 12 куб. см этилацетата и 8 куб. см смеси гексан-этилацетат (8:2, по объему) со скоростью 5 куб. см/мин.

В круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 0,2 куб. см градуировочного раствора N 1 мефеноксама с концентрацией 10,0 мкг/куб. см в этилацетате (п. 7.5.2). Отдувают растворитель током теплого воздуха, остаток растворяют в 2 куб. см смеси гексан-диэтиловый эфир (9:1, по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на колонку с оксидом алюминия, подготовленную по п. 7.2. Промывают колонку 20 куб. см смеси гексан-диэтиловый эфир (8:2, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в сек., элюат отбрасывают. Затем колонку с силикагелем промывают 30 куб. см смеси гексан-диэтиловый эфир (1:1, по объему). Фракционно (по 5 куб. см) отбирают элюат, упаривают, остатки растворяют в 1 куб. см этилацетата, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., и анализируют на содержание мефеноксама по п. 9.5. Рассчитывают содержание вещества в элюате, определяют полноту вымывания вещества из колонки и необходимый объем элюирующего агента.

Капиллярную кварцевую колонку ZB-1 (типа SE-30) устанавливают в термостат хроматографа и, не подсоединяя к детектору, кондиционируют при температуре 280 °C и скорости газа-носителя 2 куб. см/мин. в течение 8 - 10 часов.

7.5.1. Исходный раствор мефеноксама для градуировки (концентрация 100 мкг/куб. см).

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 0,010 г мефеноксама, растворяют в 40 куб. см этилацетата, доводят объем раствора этим же растворителем до метки, тщательно перемешивают.

Раствор хранят в морозильной камере при температуре не выше -18 °C в течение 3-х месяцев.

7.5.2. Раствор мефеноксама N 1 для градуировки (концентрация 10 мкг/куб. см).

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 10,0 куб. см исходного раствора мефеноксама с концентрацией 100 мкг/куб. см (п. 7.5.1), разбавляют этилацетатом до метки. Этот раствор используют для приготовления рабочих градуировочных растворов N 2 - 5.

Для приготовления проб зерна, соломы, семян и масла с внесением при оценке полноты извлечения мефеноксама из исследуемых образцов используют ацетоновый раствор мефеноксама с концентрацией 5 мкг/куб. см.

Градуировочный раствор N 1 и ацетоновый раствор мефеноксама хранят в морозильной камере при температуре не выше -18 °C в течение месяца.

7.5.3. Рабочие растворы N 2 - 5 мефеноксама для градуировки (концентрация 0,25 - 2,5 мкг/куб. см).

В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают 2,5, 5,0, 12,5 и 25,0 куб. см градуировочного раствора N 1 мефеноксама с концентрацией 10,0 мкг/куб. см (п. 7.5.2), доводят до метки этилацетатом, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 2 - 5 с концентрацией мефеноксама 0,25, 0,5, 1,25 и 2,5 мкг/куб. см, соответственно.

Растворы готовят непосредственно перед использованием.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (мВ x с) от концентрации мефеноксама в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки.

В инжектор хроматографа вводят по 1 куб. мм каждого градуировочного раствора (п. 7.5.3) и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.5. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79) и правилами, определенными ГОСТом Р 50436-92 "Зерновые. Отбор проб зерна", ГОСТом 10852-86 "Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб" и ГОСТом 8988-77 "Масло рапсовое. ТУ".

Пробы зерна, семян и соломы подсушивают до стандартной влажности и хранят в бумажных или тканевых мешочках в сухом, хорошо проветриваемом шкафу, недоступном для грызунов.

Пробы масла рапса хранят в плотно закрытой стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике при температуре 0 - 4 °C. В некоторых случаях масло получают из семян рапса экстракцией органическими неполярными растворителями (петролейный и диэтиловый эфиры) непосредственно перед проведением анализа.

9.1.1. Зерно, солома. Образец размолотого зерна (10 г) или соломы (5 г) помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 куб. см, приливают 20 куб. см дистиллированной воды и спустя 5 минут 60 куб. см ацетона. Суспензию перемешивают в течение 45 минут на аппарате для встряхивания и фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу вместимостью 250 куб. см. Осадок на фильтре промывают 40 куб. см ацетона. Экстракт и промывную жидкость объединяют и переносят в круглодонную колбу. Далее проводят очистку экстракта по пп. 9.2, 9.3 и 9.4.

9.1.2. Семена. Образец размолотых семян массой 10 г помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 куб. см, добавляют 70 куб. см ацетонитрила и помещают на аппарат для встряхивания на 1 час. Суспензию фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу вместимостью 250 куб. см. Осадок на фильтре промывают 30 куб. см ацетонитрила. Объединенный ацетонитрильный экстракт переносят в круглодонную колбу, куда добавляют 30 куб. см деионизованной воды. Дальнейшую очистку экстракта проводят по пп. 9.2, 9.3 и 9.4.

9.1.3. Масло. Образец масла массой 5 г переносят в плоскодонную колбу вместимостью 250 куб. см, добавляют 50 куб. см ацетонитрила и колбу помещают на аппарат для встряхивания на 30 минут. Верхний ацетонитрильный слой декантируют в химический стакан, а к оставшемуся в колбе маслу приливают 30 куб. см ацетонитрила и операцию экстракции повторяют. Объединенную ацетонитрильную фазу переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют 10 мин. при 10000 g. Декантируют ацетонитрильный слой в круглодонную колбу через слой ваты, помещенной в конусную воронку. После декантации вату промывают 10 куб. см ацетонитрила, которые объединяют с фильтратом. Объединенную ацетонитрильную фазу упаривают до маслянистого остатка на ротационном вакуумном испарителе при температуре 40 °C и остаток дополнительно очищают по пп. 9.3 и 9.4.

Экстракты, полученные по пп. 9.1.1 и 9.1.2 и помещенные в круглодонные колбы, упаривают на ротационном вакуумном испарителе до водного остатка при температуре не выше 40 °C. К водному остатку прибавляют 15 куб. см насыщенного раствора хлорида натрия, перемешивают и переносят в делительную воронку вместимостью 100 куб. см. В воронку вносят 30 куб. см хлористого метилена, интенсивно встряхивают в течение 2-х минут. После разделения фаз нижний органический слой сливают в делительную воронку вместимостью 250 куб. см. Операцию экстракции водной фазы повторяют еще дважды, используя по 20 куб. см хлористого метилена. Объединенную дихлорметановую фракцию переносят в делительную воронку, приливают 50 куб. см 0,1 N раствора NaOH и смесь интенсивно встряхивают в течение 2-х минут. После разделения фаз нижний органический слой фильтруют через слой безводного сульфата натрия в круглодонную колбу и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре 30 °C. Дальнейшую очистку экстракта проводят по пп. 9.3 и 9.4.

Сухой остаток экстрактов зерна, соломы и семян в круглодонной колбе, полученный по п. 9.2, растворяют в 3 куб. см смеси гексан-диэтиловый эфир (9:1, по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на колонку, подготовленную по п. 7.2. Колбу обмывают 2 куб. см смеси гексан-диэтиловый эфир (9:1, по объему), которые также наносят на колонку. Промывают колонку 15 куб. см смеси гексан-диэтиловый эфир (9:1, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в сек., элюат отбрасывают. Мефеноксам элюируют с колонки 25 куб. см смеси гексан-диэтиловый эфир (1:1, по объему), собирая элюат непосредственно в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. Раствор упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре 30 °С.

Остаток экстракта масла в круглодонной колбе, полученный по п. 9.1.3, растворяют в 2 куб. см смеси гексан-диэтиловый эфир (9:1, по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на колонку, подготовленную по п. 7.2. Колбу обмывают 1 куб. см смеси гексан-диэтиловый эфир (9:1, по объему), которые также наносят на колонку. Промывают колонку 10 куб. см смеси гексан-диэтиловый эфир (9:1, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в сек., элюат отбрасывают. Мефеноксам элюируют с колонки 12 куб. см смеси гексан-диэтиловый эфир (8:2, по объему), собирая элюат непосредственно в круглодонную колбу вместимостью 50 куб. см. Раствор упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре 30 °C.

Остаток экстракта зерна, семян, соломы или масла в круглодонной колбе, полученный по п. 9.3, растворяют при помощи ультразвуковой ванны в 2 куб. см смеси гексан-этилацетат (8:2, по объему) и переносят в подготовленный концентрирующий патрон Диапак-диол (п. 7.2). Патрон промывают 0,5 куб. см смеси гексан-этилацетат (8:2, по объему), элюат отбрасывают. Мефеноксам элюируют 3,5 куб. см смеси гексан-этилацетат (7:3, по объему) в круглодонную колбу вместимостью 25 куб. см. Раствор упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 40 °C. Остаток экстрактов зерна, семян и соломы в колбе растворяют в 2 куб. см, а масла - в 1 куб. см этилацетата, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., и анализируют на содержание мефеноксама по п. 9.5.

Колонка капиллярная кварцевая ZB-1 (типа SE-30), длина 18 м, внутренний диаметр 0,32 мм, толщина пленки 0,5 мкм, фирма Phenomenex (США)

Температура термостата испарителя - 260 °C, детектора - 300 °C, термостата колонки (программа: от 140 °C (1 мин.) со скоростью 20°/мин. до 190 °C (0 мин.); со скоростью 5°/мин. до 230 °C (0 мин.); со скоростью 20°/мин. до 260 °C (5 мин.).

Расход газов: газа-носителя (азот) - 3,0 куб. см/мин.; водорода и воздуха к ТИД - 12,3 и 200 куб. см/мин., соответственно.

Деление потока: 1:0,9.

Время удерживания мефеноксама: 5 мин. 12 сек. - 5 мин. 15 сек.

Объем вводимой пробы: 1 куб. мм.

Линейный диапазон детектирования: 0,25 - 2,5 нг.

Каждую анализируемую пробу вводят 3 раза и вычисляют среднюю площадь хроматографического пика мефеноксама.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор с концентрацией 0,5 мкг/куб. см, разбавляют этилацетатом.

Содержание мефеноксама рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе "менее нижней границы определения"

менее 0,05 мг/кг для зерна, семян и масла <*>

менее 0,1 мг/кг для соломы <**>.

--------------------------------

<*> 0,05 мг/кг - предел обнаружения для зерна колосовых культур, семян и масла рапса.

<**> 0,1 мг/кг - предел обнаружения для соломы.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R)

ГНУ ВНИИ фитопатологии.