"МУК 4.1.2668-10. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств клотианидина в воде, почве, зеленой массе, семенах и масле рапса, ботве и корнеплодах сахарной свеклы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 02.08.2010)

1. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 10.06.2010 N 1).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 2 августа 2010 г.

3. Введены впервые.

Название вещества по ИСО: Клотианидин.

Название вещества по ИЮПАК: (Е)-1-(2-хлор-1,3-тиазол-5-илметил)-3-метил-2-нитрогуанидин.

Структурная формула (не приводится).

Область применения

Клотианидин - инсектицид нервно-паралитического действия, обладает широким спектром активности против сосущих, грызущих и почвенных насекомых на овощных культурах, фруктовых и цитрусовых деревьях, рисе, кукурузе и рапсе. Вещество обладает системной активностью и может использоваться как в качестве протравителя, так и для обработки почвы и надземных органов растений.

Применяется в России в качестве инсектицида для предпосевного протравливания семян сахарной свеклы и рапса при норме расхода 20 и 10 кг д.в./т семян соответственно, а также в качестве составного компонента комбинированных протравителей.

При соблюдении всех регламентированных условий и проведении анализа в точном соответствии с данной методикой значение погрешности (и ее составляющих) результатов измерений не превышает значений, приведенных в табл. 1.

Метод основан на экстракции клотианидина из воды хлористым метиленом, из почвы и масла рапса - водным раствором метанола, из ботвы и корнеплодов сахарной свеклы, зеленой массы и семян рапса водным ацетоном, очистке экстрактов, содержащих клотианидин, от коэкстрактивных компонентов перераспределением их в системе несмешивающихся растворителей, а также на колонке с флоризилом, с последующим измерением содержания клотианидина в очищенных экстрактах на жидкостном хроматографе с ультрафиолетовым детектированием и обработкой хроматограмм методом абсолютной градуировки.

В предлагаемых условиях анализа метод специфичен.

Примечание: Допускается применение других средств измерений, вспомогательных устройств, реактивов и материалов с техническими и метрологическими характеристиками не хуже приведенных в разделе 4.

5.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работы с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.007-76, ГОСТ 12.1.005-88.

5.2. При проведении анализов горючих и вредных веществ соблюдают требования противопожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и должны быть в наличии средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-90.

5.3. При выполнении измерений с использованием хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцией по эксплуатации прибора.

5.4. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07.

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя с опытом работы на жидкостном хроматографе.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией "лаборант", имеющего опыт работы в химической лаборатории.

7.1. При выполнении измерений соблюдают следующие условия.

Приготовление растворов и подготовку проб к анализу проводят в следующих условиях:

- температура воздуха (20 +/- 5) °C,

- атмосферное давление (84 - 106) кПа,

- относительная влажность воздуха не более 80%.

7.2. Условия хроматографического анализа

Температура колонки: комнатная.

Подвижная фаза: ацетонитрил-вода (20:80, по объему).

Скорость потока элюента: 0,7 куб. см/мин.

Время удерживания клотианидина: 9,2 мин.

Рабочая длина волны: 270 нм.

Чувствительность: 0,01 ед. абсорбции на шкалу.

Объем вводимой пробы: 20 куб. мм.

Линейный диапазон детектирования 1 - 10 нг.

Измерениям предшествуют следующие операции: приготовление растворов, приготовление подвижной фазы для ВЭЖХ, подготовка колонки с флоризилом, кондиционирование хроматографической колонки, градуировка хроматографа.

Срок хранения - 1 неделя.

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 200 куб. см ацетонитрила, 800 куб. см деионизованной воды, перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр.

Срок хранения - 1 неделя.

Промывают колонку подвижной фазой, приготовленной по 8.2, при скорости подачи растворителя 1 куб. см/мин. не менее часа.

В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 8 - 10 мм помещают тампон из стекловаты и затем в нее выливают суспензию 10 г флоризила в 10 куб. см этилацетата. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку промывают 20 куб. см этилацетата со скоростью 1 - 2 капли в секунду, после чего она готова к работе.

При отработке методики или поступлении новой партии флоризила проводят определение объема элюента, необходимого для полного вымывания клотианидина из колонки с флоризилом.

В круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 0,2 куб. см градуировочного раствора N 1 клотианидина с массовой концентрацией 10 мкг/куб. см в ацетонитриле, раствор упаривают досуха, остаток растворяют в 3 куб. см этилацетата, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на колонку, подготовленную по 8.4. Промывают колонку 40 куб. см этилацетата со скоростью 1 - 2 капли в секунду, элюат отбрасывают. Затем через колонку пропускают 40 куб. см ацетонитрила, отбирая последовательно по 5 куб. см элюата. Каждую фракцию упаривают, остатки растворяют в 1 куб. см ацетонитрила, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., вносят 2 куб. см подвижной фазы, подготовленной по 8.2, перемешивают, а затем хроматографируют. Условия хроматографирования - в соответствии с 7.2.

По результатам обнаружения клотианидина в каждой из фракций определяют объем ацетонитрила, необходимый для полного вымывания клотианидина с колонки.

8.6.1. Приготовление исходного раствора клотианидина для градуировки с массовой концентрацией 100 мкг/куб. см

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают (0,010 +/- 0,0002) г клотианидина, растворяют в (40 - 50) куб. см ацетонитрила, доводят ацетонитрилом до метки, тщательно перемешивают.

Раствор хранят в морозильной камере при температуре не выше (-18) °C. Срок хранения не более 3-х месяцев.

8.6.2. Приготовление раствора клотианидина для градуировки с массовой концентрацией 10 мкг/куб. см (раствор N 1)

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 10 куб. см исходного раствора клотианидина с массовой концентрацией 100 мкг/куб. см (8.6.1), разбавляют ацетонитрилом до метки. Этот раствор используют для приготовления градуировочных растворов N 2 - 5.

Для приготовления проб воды, почвы, зеленой массы, семян, ботвы, корнеплодов и масла с внесением при оценке полноты извлечения клотианидина из исследуемых образцов используют ацетоновые растворы клотианидина с массовой концентрацией 1 и 10 мкг/куб. см.

Градуировочный раствор N 1 и ацетоновые растворы клотианидина хранят в морозильной камере при температуре не выше (-18) °C. Срок хранения не более 1 месяца.

8.6.3. Приготовление градуировочных растворов клотианидина с массовой концентрацией 0,05 - 0,5 мкг/куб. см (растворы N 2 - 5)

В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают 0,5, 1,0, 2,5 и 5,0 куб. см градуировочного раствора N 1 клотианидина с массовой концентрацией 10 мкг/куб. см, доводят до метки подвижной фазой, приготовленной по 8.2, тщательно перемешивают. Получают растворы с массовой концентрацией клотианидина 0,05, 0,10, 0,25 и 0,5 мкг/куб. см соответственно.

Растворы готовят непосредственно перед использованием.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (кв. мм) от массовой концентрации клотианидина в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной градуировки по 4-м растворам.

В инжектор хроматографа вводят по 20 куб. мм каждого градуировочного раствора (8.6.3) и анализируют при условиях 7.2. Каждый раствор хроматографируют дважды. Расхождение между параллельными определениями не должно превышать предела повторяемости r.

По полученным данным строят градуировочную характеристику.

Контроль стабильности градуировки проводят не реже 1 раза в три месяца, а также при смене реактивов или изменении условий анализа.

Для контроля стабильности используют вновь приготовленные градуировочные растворы с массовой концентрацией исследуемого вещества в начале, середине и в конце диапазона измерений, которые анализируют в точном соответствии с методикой.

Градуировочную характеристику считают стабильной, если для каждого контрольного образца выполняется условие (1):

Если условие стабильности не выполняется только для одного образца, то повторно анализируют этот образец для исключения результата, содержащего грубую ошибку.

Если градуировка нестабильна, выясняют причины нестабильности и повторяют контроль стабильности с использованием других образцов для градуировки, предусмотренных методикой. При повторном обнаружении нестабильности градуировки прибор градуируют заново.

Отбор проб производят в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79) и правилами, определенными ГОСТ Р 51592-2000 "Вода. Общие требования к отбору проб", 1743.01-83 "Почвы. Общие требования к отбору проб", 26950-89 "Почвы. Отбор проб", 10852-86 "Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб", 8988-77 "Масло рапсовое. ТУ", 17421-82 "Свекла сахарная для промышленной переработки. Требования при заготовках".

Пробы воды анализируют в день отбора или замораживают и хранят в полиэтиленовой таре в морозильной камере при температуре (-18) °C не более 2-х недель.

Образцы почвы подсушивают при комнатной температуре в течение 24 часов на воздухе в темноте, помещают в герметичную полиэтиленовую тару и хранят в холодильнике при температуре (4 - 6) °C не более 4-х недель. Для длительного хранения образцы почвы замораживают и хранят при температуре (-18) °C.

Пробы зеленой массы, ботвы и корнеплодов хранят в холодильнике при температуре (0 - 4) °C не более суток; для длительного хранения пробы замораживают и хранят в полиэтиленовой таре в морозильной камере при температуре (-18) °C.

Пробы семян подсушивают при комнатной температуре до влажности в соответствии ГОСТ 10852-86 и хранят в бумажных или тканевых мешочках в хорошо проветриваемом шкафу.

Масло хранят в плотно закрытой стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике при температуре (0 - 4) °C. Допускается получение масла из семян рапса экстракцией органическими неполярными растворителями.

Перед анализом образцы воды фильтруют через бумажный фильтр, образцы почвы просеивают через сито с диаметром отверстий 1 мм, семена размалывают на мельнице, а ботву и корнеплоды измельчают ножницами, ножом или с помощью терки.

9.1.1. Экстракция клотианидина из образцов воды

100 куб. см предварительно отфильтрованной воды помещают в делительную воронку вместимостью 250 куб. см, добавляют 30 куб. см хлористого метилена и интенсивно встряхивают воронку в течение 2-х минут. После разделения фаз нижний органический слой отделяют, фильтруют через слой безводного сульфата натрия в круглодонную колбу. Водную фазу экстрагируют хлористым метиленом еще дважды порциями по 30 куб см. Объединенную дихлорметановую фракцию упаривают досуха на роторном вакуумном испарителе при температуре 30 °C. Далее проводят очистку экстракта от коэкстрактивных примесей по 9.3.

9.1.2. Экстракция клотианидина из образцов почвы

Образец воздушно-сухой почвы массой 25 г помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 куб. см, добавляют 125 куб. см смеси метанол-вода (9:1, по объему), перемешивают и колбу помещают на встряхиватель на 1 час. Суспензию фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу Бунзена вместимостью 250 куб. см. Почву повторно экстрагируют 75 куб. см указанной выше смеси в течение 30 минут при встряхивании и фильтруют. Осадок на фильтре промывают 50 куб. см метанола. Экстракты и промывную жидкость объединяют, измеряют объем раствора и 1/5 часть экстракта (эквивалентна 5 г образца) переносят в круглодонную колбу. Дальнейшую очистку экстракта от коэкстрактивных примесей проводят по 9.2.

9.1.3. Экстракция клотианидина из образцов зеленой массы, ботвы, корнеплодов

Навеску (25 г) измельченного растительного материала помещают в стакан гомогенизатора вместимостью 500 куб. см, приливают 125 куб. см смеси ацетон-вода (3:1, по объему) и гомогенизируют 3 минуты при 8000 об./мин. Гомогенат фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу Бунзена вместимостью 250 куб. см. Осадок на фильтре промывают 50 куб. см смеси ацетон-вода (3:1). Экстракт и промывную жидкость переносят в химический стакан, перемешивают, измеряют объем раствора и 1/5 его часть (эквивалентна 5 г образца) переносят в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. Дальнейшую очистку экстракта от коэкстрактивных примесей проводят по 9.2.

9.1.4. Экстракция клотианидина из образцов семян

Образец размолотых семян массой 10 г помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 куб. см, добавляют 100 куб. см смеси ацетон-вода (3:1, по объему) и колбу помещают на аппарат для встряхивания на 40 минут. Суспензию фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу Бунзена вместимостью 250 куб. см. Осадок на фильтре промывают 50 куб. см приведенной выше смеси. Экстракт и промывную жидкость переносят в химический стакан, перемешивают, измеряют объем раствора и 1/2 его часть (эквивалентна 5 г образца) переносят в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. Дальнейшую очистку экстракта от коэкстрактивных примесей проводят по 9.2.

9.1.5. Экстракция клотианидина из образцов масла

Образец масла массой 5 г вносят в делительную воронку вместимостью 100 куб. см, добавляют 15 куб. см гексана, перемешивают. К раствору добавляют 50 куб. см 80%-ного водного метанола, и воронку интенсивно встряхивают в течение 2-х минут. После разделения фаз декантируют водно-метанольный слой в круглодонную колбу через слой ваты, помещенной в конусную воронку. Маслянистый остаток повторно обрабатывают 50 куб. см 80%-ного водного метанола и водно-метанольные экстракты объединяют. Дальнейшую очистку экстракта от коэкстрактивных примесей проводят по 9.2.

Приготовление водного раствора метанола с массовой долей 80%.

В мерную колбу вместимостью 500 куб. см количественно переносят 400 куб. см метанола. Объем раствора в колбе доводят до метки дистиллированной водой.

Срок хранения - 1 неделя.

Отобранные аликвоты экстрактов почвы и растительного материала (9.1.2, 9.1.3 и 9.1.4), а также экстракт масла (9.1.5) упаривают на ротационном вакуумном испарителе до водного остатка объемом 3 - 5 куб. см при температуре 40 °C. К водному остатку приливают 20 куб. см деионизованной воды, перемешивают и переносят в делительную воронку вместимостью 100 куб. см. В воронку вносят 30 куб. см хлористого метилена, интенсивно встряхивают в течение 2-х минут. После разделения фаз нижний органический слой собирают в делительную воронку вместимостью 250 куб. см, а водную фазу экстрагируют еще дважды, используя по 30 куб. см хлористого метилена. К объединенной дихлорметановой фракции в делительной воронке приливают 25 куб. см водного раствора углекислого калия с молярной концентрацией 0,05 моль/куб. дм, содержимое интенсивно встряхивают в течение 2 минут. После разделения фаз нижний органический слой фильтруют через слой безводного сульфата натрия в круглодонную колбу и затем упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре 30 °C. Дальнейшую очистку экстракта проводят по 9.3.

Сухие остатки в круглодонной колбе, полученные по 9.1.1 и 9.2, растворяют в 3 куб. см этилацетата, помещая в ультразвуковую ванну на 1 минуту. Раствор наносят на колонку, подготовленную по 8.4. Колбу обмывают 5 куб. см этилацетата, раствор этилацетата также наносят на колонку. Колонку промывают 35 куб. см этилацетата со скоростью 1 - 2 капли в секунду, элюат отбрасывают. Клотианидин элюируют с колонки 25 куб. см ацетонитрила непосредственно в грушевидную колбу. Раствор упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре 40 °C. Сухой остаток экстракта почвы растворяют в 1 куб. см, воды и семян рапса - в 2 куб. см, а ботвы и корнеплодов сахарной свеклы, зеленой массы и масла рапса - в 5 куб. см подвижной фазы для ВЭЖХ, раствор помещают в ультразвуковую ванну на 1 минуту и анализируют на содержание клотианидина по 10.

Полнота извлечения клотианидина при проведении всех операций подготовки пробы не менее 84%.

10.1. В инжектор хроматографа вводят 20 куб. мм очищенного экстракта анализируемой пробы (9.1.1 - 9.1.5), анализируют при условиях (7.2) и регистрируют хроматограмму. Каждый экстракт хроматографируют дважды.

10.2. Для каждого образца воды, почвы, зеленой массы рапса, ботвы и корнеплодов сахарной свеклы, семян и масла рапса повторяют операции по 9.1 - 9.3, 10.1.

11.1. Для обработки результатов хроматографического анализа используют программу сбора и обработки хроматографической информации "МультиХром для Windows", версия 1.5x.

Альтернативная обработка результатов.

По градуировочной характеристике находят значение массовой концентрации клотианидина в экстрактах, C, мкг/куб. см.

Массовую концентрацию клотианидина X, мг/куб. дм, в образцах воды рассчитывают по формуле (2):

11.2. За результат измерений принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, если выполняется условие приемлемости (4):

Если условие (4) не выполняется, выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и повторяют выполнение измерений в соответствии с требованиями МВИ.

11.3. Результат анализа в документах, предусматривающих его использование, представляют в виде:

В случае, если полученный результат измерений ниже нижней (выше верхней) границы диапазона измерений, то производят следующую запись в журнале:

"массовая концентрация клотианидина в воде менее 0,001 мг/куб. дм (более 0,01 мг/куб. дм)";

Экстракты, при хроматографировании которых получают аналитический сигнал клотианидина, превышающий аналитический сигнал, получаемый при хроматографировании градуировочного раствора с массовой концентрацией 0,5 мкг/куб. см, разбавляют, но не более чем в 10 раз, и анализируют в соответствии с данной методикой. При расчете содержания клотианидина учитывают разбавление.

12.1. Проверку приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости проводят:

а) при возникновении спорных ситуаций между двумя лабораториями;

б) при проверке совместимости результатов измерений, полученных при сличительных испытаниях (при проведении аккредитации лабораторий и инспекционного контроля).

12.2. Для проведения проверки приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости каждая лаборатория использует пробы, оставленные на хранение.

Если критическая разность не превышена, то приемлемы оба результата измерений, проводимых двумя лабораториями, и в качестве окончательного результата используют их среднеарифметическое значение. Если критическая разность превышена, то выполняют процедуры, изложенные в ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 (5.3.3).

При разногласиях руководствуются ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 (5.3.4).

Контроль качества результатов измерений в лаборатории при реализации методики осуществляют по ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 ("Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений"), используя контроль стабильности среднеквадратического (стандартного) отклонения повторяемости по 6.2.2 ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 и показателя правильности по 6.2.4 ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002. Проверку стабильности осуществляют с применением контрольных карт Шухарта.

Периодичность контроля стабильности результатов выполнения измерений регламентируют в Руководстве по качеству лаборатории.

Рекомендуется устанавливать контролируемый период так, чтобы количество результатов контрольных измерений было от 20 до 30.

При неудовлетворительных результатах контроля, например при превышении предела действия или регулярном превышении предела предупреждения, выясняют причины этих отклонений, в том числе проводят смену реактивов, проверяют работу оператора.

ВНИИ фитопатологии.