"МУК 4.1.2285-07. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств люфенурона в ягодах и соке винограда методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 28.09.2007)

1. Разработаны Всероссийским научно-исследовательским институтом фитопатологии.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-гигиеническому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол N 2 от 21 июня 2007 г.).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 28 сентября 2007 г.

4. Вводятся в действие с 10 декабря 2007 г.

5. Введены впервые.

Настоящие Методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации люфенурона в ягодах и соке винограда в диапазоне 0,02 - 0,2 мг/кг.

Название вещества по ИСО: Люфенурон.

Название вещества по ИЮПАК: (RS)-1-/2,5-дихлор-4-(1,1,2,3,3,3-гексафтор-пронокси)фенил/-3-(2,6-дифтор-бензоил)мочевина.

Структурная формула (не приводится).

Рекомендуемый норматив для люфенурона в винограде - 0,1 мг/кг.

Область применения

Люфенурон - инсектоакарицид из группы ингибиторов синтеза хитина, эффективно уничтожает листогрызущие личинки чешуекрылых и жесткокрылых, эриофиидных клещей на хлопчатнике, овощных и декоративных культурах, винограде, семечковых плодовых, картофеле и кукурузе в течение вегетационного периода.

Применяется в России в качестве инсектоакарицида для обработки яблоневых садов, посадок картофеля и томатов при норме расхода 15 - 50 г д.в./га и одно-, двукратной обработке за сезон. Помимо этого, люфенурон в составе смесевых препаратов используется на посадках косточковых плодовых культур и виноградниках.

Метрологические характеристики метода представлены в табл. 1 и 2.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в таблице 2.

Методика основана на определении вещества с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовым детектором. Контроль люфенурона в матрице осуществляется по содержанию вещества после экстракции его из ягод метанолом, а из сока хлористым метиленом, очистки экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей, а также на колонке с силикагелем и концентрирующем патроне Диапак С8.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичной или более высокой квалификацией.

Допускается применение другого оборудования с аналогичными или лучшими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостной хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя с опытом работы на жидкостном хроматографе.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией "лаборант", имеющего опыт работы в химической лаборатории.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °С и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление растворов, подвижной фазы для ВЭЖХ, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики, подготовка колонки с силикагелем и концентрирующих патронов Диапак С8.

7.1.1. Очистка ацетонитрила

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора не менее 1 часа, после чего перегоняют. Перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом натрия.

7.1.2. Очистка н-гексана

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до прекращения ее окрашивания в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над поташом.

7.1.3. Очистка этилацетата

Этилацетат промывают последовательно 5%-ным водным раствором карбоната натрия, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над безводным карбонатом калия и перегоняют.

Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 8 - 10 мм уплотняют тампоном из стекловаты, медленно выливают в колонку (при открытом кране) суспензию 5 г силикагеля в 20 куб. см гексана. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку промывают 20 куб. см смеси гексан - этилацетат (1:9, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в сек., затем 30 куб. см смеси гексан - этилацетат (9:1, по объему). После этого колонка готова к работе.

В круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 0,1 куб. см градуировочного раствора N 1 люфенурона с концентрацией 10 мкг/куб. см в ацетонитриле (п. 7.7.2) и отдувают растворитель током азота. Остаток растворяют в 0,3 куб. см этилацетата, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., добавляют 2,7 куб. см гексана, перемешивают и вновь помещают в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на колонку с силикагелем, подготовленную по п. 7.2. Промывают колонку 50 куб. см смеси гексан - этилацетат (9:1, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в сек., элюат отбрасывают. Затем колонку промывают 60 куб. см смеси гексан - этилацетат (8:2, по объему). Фракционно (по 10 куб. см) отбирают элюат, упаривают, остатки растворяют в 1 куб. см ацетонитрила, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., вносят 1 куб. см подвижной фазы, подготовленной по п. 7.5, перемешивают и анализируют на содержание люфенурона по п. 9.5.

Концентрирующий патрон Диапак С8 промывают с помощью медицинского шприца 5 куб. см ацетонитрила со скоростью прохождения растворителя через патрон 1 - 2 капли в сек., затем 5 куб. см смеси ацетонитрил - вода (5:5, по объему). Патрон готовят непосредственно перед использованием для очистки экстракта.

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 600 куб. см ацетонитрила, 400 куб. см деионизованной воды, перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр.

Промывают колонку для ВЭЖХ подвижной фазой, приготовленной по п. 7.5, при скорости подачи растворителя 1 куб. см /мин. не менее 2-х часов до установления стабильной базовой линии.

7.7.1. Исходный раствор люфенурона для градуировки (концентрация 100 мкг/куб. см). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 0,010 г люфенурона, растворяют в 40 - 50 куб. см ацетонитрила, доводят ацетонитрилом до метки, тщательно перемешивают.

Раствор хранят в морозильной камере при температуре -18 °С в течение 3-х месяцев.

7.7.2. Раствор люфенурона N 1 для градуировки (концентрация 10 мкг/куб. см)

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 10 куб. см исходного раствора люфенурона с концентрацией 100 мкг/куб. см (п. 7.7.1), разбавляют ацетонитрилом до метки. Этот раствор используют для приготовления рабочих градуировочных растворов N 2 - 5, а также проб ягод и сока с внесением при оценке полноты извлечения люфенурона из исследуемых образцов.

Градуировочный раствор N 1 хранят в морозильной камере при температуре не выше -18 °С в течение месяца.

7.7.3. Рабочие растворы N 2 - 5 люфенурона для градуировки (концентрация 0,05 - 0,5 мкг/куб. см)

В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают 0,5, 1,0, 2,5 и 5,0 куб. см градуировочного раствора N 1 люфенурона с концентрацией 10 мкг/куб. см (п. 7.7.2), доводят до метки подвижной фазой, приготовленной по п. 7.5, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 2 - 5 с концентрацией люфенурона 0,05, 0,1, 0,25 и 0,5 мкг/куб. см соответственно.

Растворы готовят непосредственно перед употреблением.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость высоты пика (мм) от концентрации люфенурона в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки.

В инжектор хроматографа вводят по 20 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.5.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов (N 2051-79 от 21.08.79) и правилами, определенными ГОСТом 25896-83 "Виноград свежий столовый". Пробы ягод хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике не более 1 дня; для длительного хранения пробы замораживают и хранят в морозильной камере при температуре -18 °С. Сок получают из ягод непосредственно перед проведением анализа. Перед анализом ягоды измельчают.

9.1.1. Ягоды. Навеску измельченного растительного материала массой 25 г помещают в стакан гомогенизатора вместимостью 500 куб. см, приливают 100 куб. см метанола и гомогенизируют 3 мин. при 10000 об./мин. Суспензию фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу вместимостью 250 куб. см. Остаток на фильтре промывают 50 куб. см метанола. Экстракт и промывную жидкость переносят в химический стакан вместимостью 500 куб. см, перемешивают, измеряют объем раствора, 1/5 его часть (эквивалентна 5 г образца) переносят в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. Дальнейшую очистку экстракта проводят по п. 9.2.

9.1.2. Сок. Навеску (20 г) свежевыжатого сока помещают в химический стакан вместимостью 100 куб. см, приливают 60 куб. см деионизованной воды, перемешивают, измеряют объем раствора. Отбирают 1/4 объема раствора (эквивалентна 5 г образца), переносят в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. Дальнейшую очистку экстракта проводят по п. 9.2.

Отобранные аликвоты экстрактов ягод и сока (из п. п. 9.1.1 и 9.1.2) упаривают на ротационном вакуумном испарителе до водного остатка (1 - 2 куб. см) при температуре 40 °С. К водному остатку приливают 50 куб. см деионизованной воды, 20 куб. см насыщенного раствора хлорида натрия, перемешивают и переносят в делительную воронку вместимостью 250 куб. см. В воронку вносят 30 куб. см хлористого метилена, интенсивно встряхивают в течение 2-х минут. После разделения фаз органический слой фильтруют через слой безводного сульфата натрия в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. Операцию экстракции водной фазы повторяют еще дважды, используя по 20 куб. см хлористого метилена. Объединенную органическую фракцию, пропущенную через слой безводного сульфата натрия, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре 30 °С. Дальнейшую очистку экстракта проводят по п. п. 9.3 и 9.4.

Сухой остаток в круглодонной колбе, полученный по п. 9.2, растворяют в 0,3 куб. см этилацетата, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., добавляют 2,7 куб. см гексана, перемешивают, вновь помещают в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на колонку, подготовленную по п. 7.2. Колбу обмывают 5 куб. см смеси гексан - этилацетат (9:1, по объему), которые также наносят на колонку. Промывают колонку 40 куб. см смеси гексан - этилацетат (9:1, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в сек., элюат отбрасывают. Люфенурон элюируют с колонки 60 куб. см смеси гексан - этилацетат (8:2, по объему), собирая элюат непосредственно в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. Раствор упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре 40 °С, и остаток подвергают дополнительной очистке на концентрирующем патроне Диапак С8 по п. 9.4.

Сухой остаток в круглодонной колбе, полученный по п. 9.3, растворяют в 1,5 куб. см ацетонитрила, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., добавляют 1,5 куб. см деионизованной воды, перемешивают, вновь помещают в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор вносят с помощью медицинского шприца на концентрирующий патрон Диапак С8, подготовленный по п. 7.4, со скоростью 1 - 2 капли в сек. Колбу обмывают 3 куб. см смеси ацетонитрил - вода (5:5, по объему), которые также вносят на патрон. После нанесения пробы патрон промывают 5 куб. см смеси ацетонитрил - вода (5:5, по объему), элюат отбрасывают. Люфенурон элюируют с патрона 13 куб. см смеси ацетонитрил - вода (7:3, по объему) в круглодонную колбу вместимостью 50 куб. см. Раствор упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре 40 °С. Остаток в колбе растворяют в 1 куб. см ацетонитрила, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., вносят 1 куб. см подвижной фазы, подготовленной по п. 7.5, перемешивают и анализируют на содержание люфенурона по п. 9.5.

Жидкостной хроматограф с ультрафиолетовым детектором (фирмы Knauer, Германия).

Колонка стальная длиной 15 см, внутренним диаметром 4 мм, заполненная Диасфером 110-С18 (5 мкм).

Температура колонки: комнатная.

Подвижная фаза: ацетонитрил - вода (6:4, по объему).

Скорость потока элюента: 1,0 куб. см/мин.

Рабочая длина волны: 254 нм.

Чувствительность детектора: 0,005 ед. абсорбции на шкалу.

Объем вводимой пробы: 20 куб. мм.

Время удерживания люфенурона: 19 мин.

Линейный диапазон детектирования: 1 - 10 нг.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор с концентрацией 0,5 мкг/куб. см, разбавляют подвижной фазой, приготовленной по п. 7.5.

Альтернативная неподвижная фаза: Диасорб 130-С16 (5 мкм).

Время удерживания люфенурона: около 21,2 мин.

Содержание люфенурона рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

где дельта - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе "менее нижней границы определения" менее 0,02 мг/кг для ягод и сока винограда <*>.

--------------------------------

<*> 0,02 мг/кг - предел обнаружения для ягод и сока винограда.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

ГНУ ВНИИ фитопатологии.