"МУК 4.1.2214-07. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств имазамокса и имазапира в семенах подсолнечника, сои и растительных маслах при совместном присутствии методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 25.05.2007)

1. Разработаны Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана.

2. Рекомендованы к утверждению комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол N 1 от 29.03.2007).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 25 мая 2007 г.

4. Введены впервые.

Настоящие Методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовых концентраций имазамокса и имазапира в семенах подсолнечника и сои, а также растительных маслах в диапазоне 0,1 - 1 мг/кг.

Имазамокс и имазапир - действующие вещества препарата ЕВРОЛАЙТНИНГ, ВРК (33 г/л имазамокса + 15 г/л имазапира), фирма-производитель "БАСФ".

Имазамокс

(RS)-2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)-5-метоксиметилникотиновая кислота (IUPAC).

Структурная формула (не приводится).

Имазапир

2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолон-2-ил)никотиновая кислота (IUPAC).

Структурная формула (не приводится).

Мол. масса 261,3.

Порошок от белого до желто-коричневого цвета со слабым запахом уксусной кислоты. Температура плавления 169 - 173 °С. Давление паров при 60 °С: менее 0,013 мПа. Растворимость в органических растворителях при 25 °С (г/100 куб. см): дихлорметан - 8,72; ацетон - 3,39; метанол - 10,5; толуол - 0,18; гексан - 0,00095. Растворимость в воде (г/куб. дм): 9,74 (15 °С); 11,3 (25 °С).

Область применения препарата

Препарат Евролайтнинг, ВРК рекомендуется в качестве гербицида для борьбы с однолетними двудольными и злаковыми сорняками в посевах подсолнечника и сои (опрыскивание в период вегетации).

ВМДУ имазамокса в семенах и масле сои - 1 мг/кг. Рекомендуемые ВМДУ имазамокса и имазапира в семенах и масле подсолнечника, имазапира в семенах и масле сои - 1 мг/кг.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения веществ, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в таблице 2.

Методика основана на определении вещества с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовым детектором после экстракции анализируемых проб семян подсолнечника и сои смесью метанол-соляная кислота, растительного масла - ацетонитрил-вода-уксусная кислота, последовательной 2-стадийной очистки на концентрирующих патронах C18 Sep Pak. Экстракт семян подсолнечника дополнительно очищают на патронах Sep Pak Silica.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

В предлагаемых условиях определения метод специфичен в присутствии компонентов препаративной формы.

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичной или более высокой квалификацией.

Допускается применение другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостной хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на жидкостном хроматографе.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией "лаборант", имеющего опыт работы в химической лаборатории.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °С и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление растворов, градуировочных растворов, растворов внесения, подвижных фазы для ВЭЖХ, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики, подготовка концентрирующих патронов C18 Sep Pak и Sep Pak Silica.

7.1.1. Ацетонитрил

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора не менее 1 часа, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия.

7.1.2. Гексан

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты, до тех пор, пока она не перестанет окрашиваться в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над поташом.

7.1.3. Хлористый метилен и этилацетат

Каждый растворитель промывают последовательно 5%-ным водным раствором карбоната натрия, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над безводным карбонатом калия и перегоняют или подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретических тарелок не менее 50.

Для приготовления 1 N раствора в мерную колбу вместимостью 1000 куб. см, содержащую 300 - 400 куб. см деионизованной воды, помещают 83 куб. см концентрированной соляной кислоты, доводят водой до метки, тщательно перемешивают.

Для приготовления 0,05, 0,025 и 0,01 N растворов в мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают соответственно 50, 25 и 10 куб. см 1 N раствора соляной кислоты, доводят водой до метки, тщательно перемешивают.

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 600 куб. см метанола, вносят 400 куб. см 0,025 N раствора соляной кислоты, перемешивают.

В колбу вместимостью 1000 - 1500 куб. см помещают 500 куб. см ацетонитрила, вносят 500 куб. см деионизованной воды и 20 куб. см ледяной уксусной кислоты, перемешивают.

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 3,85 г уксуснокислого аммония, доводят водой до метки, вносят 1 куб. см ледяной уксусной кислоты, перемешивают.

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 25 куб. см метанола, доводят до метки 0,05 М раствором уксуснокислого аммония, перемешивают.

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 2 куб. см ледяной уксусной кислоты, доводят до метки этилацетатом, перемешивают.

7.8.1. Первая ступень очистки. Концентрирующий патрон промывают с помощью медицинского шприца 5 куб. см метанола со скоростью прохождения растворителя через патрон 1 - 2 капли в сек., затем 5 куб. см 0,01 N раствора соляной кислоты.

7.8.2. Вторая ступень очистки. Концентрирующий патрон промывают с помощью медицинского шприца последовательно гексаном, хлористым метиленом, метанолом, водой, 0,05 N раствором соляной кислоты порциями по 3 куб. см.

Патроны готовят непосредственно перед использованием.

Концентрирующий патрон промывают с помощью медицинского шприца последовательно метанолом, этилацетатом, хлористым метиленом порциями по 5 куб. см.

Патроны готовят непосредственно перед использованием. Нельзя допускать высыхания верхнего слоя сорбента.

7.10.1. Для определения имазамокса и имазапира в семенах сои, растительных маслах, имазамокса - семенах подсолнечника

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 220 куб. см ацетонитрила, 780 куб. см деионизованной воды, 1 куб. см орто-фосфорной кислоты, перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр.

7.10.2. Для определения имазапира в семенах подсолнечника

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 160 куб. см ацетонитрила, 20 куб. см метанола, 820 куб. см деионизованной воды, 1 куб. см орто-фосфорной кислоты, перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр.

Промывают колонку подвижной фазой (приготовленной по п. 7.10.1 или 7.10.2) при скорости подачи растворителя 1 куб. см/мин. не менее 2-х часов до установления стабильной базовой линии.

7.12.1. Исходные растворы имазамокса и имазапира для градуировки (концентрация 100 мкг/куб. см). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 0,01 г имазамокса (имазапира), растворяют в 50 - 70 куб. см метанола, доводят до метки этим же растворителем, тщательно перемешивают. Раствор хранится в холодильнике в течение 3-х месяцев.

Градуировочные растворы N 2 - 5 действующих веществ готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходных растворов.

7.12.2. Растворы N 1 имазамокса и имазапира для градуировки (концентрация 10 мкг/куб. см). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 1,0 куб. см исходного раствора имазамокса или имазапира с концентрацией 100 мкг/куб. см (п. 7.12.1), доводят до метки метанолом, тщательно перемешивают.

Растворы хранятся в холодильнике не более месяца.

7.12.3. Рабочие растворы N 2 - 5 имазамокса и имазапира для градуировки (концентрация 0,1 - 1 мкг/куб. см). В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают по 1,0, 2,5, 5,0 и 10 куб. см растворов N 1 имазамокса и имазапира с концентрацией 10 мкг/куб. см (п. 7.12.2), доводят до метки подвижной фазой, приготовленной по п. 7.10.1, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 2 - 5 с концентрацией имазамокса и имазапира 0,1, 0,25, 0,5 и 1,0 мкг/куб. см, соответственно.

Растворы хранятся в холодильнике не более 5-ти дней.

7.13.1. Исходные растворы (концентрация 100 мкг/куб. см). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 0,01 г имазамокса (имазапира), растворяют в 50 - 70 куб. см изопропилового спирта, доводят им же до метки, тщательно перемешивают.

7.13.2. Основной раствор имазамокса и имазапира для внесения (концентрация каждого действующего вещества 10 мкг/куб. см).

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают по 10,0 куб. см исходных растворов имазапира и имазамокса с концентрацией 100 мкг/куб. см (п. 7.13.1), доводят до метки изопропанолом, тщательно перемешивают.

Раствор хранится в холодильнике не более месяца.

Этот раствор используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения действующего вещества методом "внесено-найдено".

Градуировочные характеристики, выражающие зависимость площадей пиков (отн. единицы) от концентрации имазамокса и имазапира в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4-м растворам для градуировки N 2 - 5.

В инжектор хроматографа вводят 20 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.3.1 или 9.3.2. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений.

Отбор проб производится в соответствии с правилами, определенными ГОСТами 10852-86 "Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб", 17109-88 "Соя. Требования при заготовках и поставках", 22391-89 "Подсолнечник. Требования при заготовках и поставках", "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79).

Семена подсушивают в темноте до постоянного веса и хранят в тканевых мешочках в сухом, защищенном от света месте при комнатной температуре не более 6-ти месяцев. Измельченные пробы зерна (аналитические образцы массой 20 г) замораживают и хранят при температуре -18 °С.

Пробы масла (помещенные в стеклянные флаконы) хранят в холодильнике в течение 3-х месяцев.

Перед анализом образцы подсушенных семян измельчают.

9.1.1. Экстракция

Образец измельченных семян массой 20 г помещают в плоскодонную колбу вместимостью 400 куб. см на шлифе, добавляют 200 куб. см смеси для экстракции (метанол-0,025 N раствор соляной кислоты, 60:40, по объему), приготовленной по п. 7.3, интенсивно перемешивают в течение 5 мин.

Пробам дают отстояться, затем надосадочную жидкость фильтруют на воронке Бюхнера с помощью разряжения, создаваемого водоструйным насосом, через двойной фильтр "красная лента", осадок на фильтре промывают 25 куб. см метанола. Отфильтрованный экстракт переносят в мерный цилиндр вместимостью 250 куб. см с пришлифованной пробкой, перемешивают, измеряют объем раствора, 1/5 его часть, эквивалентную 4 г семян (около 40 куб. см), переносят в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см, упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °С до объема 8 - 10 куб. см. Очищают на концентрирующих патронах C18 Sep Pak по п. 9.1.2.1.

9.1.2. Очистка экстракта

9.1.2.1. Очистка экстракта на концентрирующих патронах C18 Sep Pak

Раствор в колбе, полученный по п. 9.1.1, вносят с помощью медицинского шприца на концентрирующий патрон C18 Sep Pak, подготовленный по п. 7.8.1, со скоростью пропускания раствора 1 - 2 капли в сек. После нанесения пробы патрон промывают 5 куб. см 0,01 N раствора соляной кислоты, элюат отбрасывают. Вещества элюируют с патрона 9 куб. см 25%-ного раствора метанола в 0,05 М растворе ацетата аммония (приготовленного по п. 7.6), собирая элюат в круглодонную колбу, упаривают его при температуре не выше 40 °С до объема около 3 куб. см.

Полученный раствор вносят с помощью медицинского шприца на концентрирующий патрон C18 Sep Pak, подготовленный по п. 7.8.2. Колбу ополаскивают дважды по 1 куб. см деионизованной воды, растворы также вносят на патрон. Скорость прохождения раствора через патрон не должна превышать 1 - 2 капли в сек.

Промывают патрон 3 куб. см деионизованной воды, затем 3 куб. см гексана. Гексан продавливают до нижнего края сорбента. Элюаты отбрасывают. Имазапир и имазамокс элюируют с патрона 15 куб. см хлористого метилена, собирая элюат непосредственно в круглодонную колбу. При анализе проб семян сои и растительных масел раствор упаривают досуха при температуре не выше 35 °С. Сухой остаток растворяют в 4 куб. см подвижной фазы для ВЭЖХ (приготовленной по п. 7.10.1), центрифугируют (фильтруют через слой стекловаты, помещенный в конусную химическую воронку) и анализируют содержание имазамокса и имазапира по п. 9.3.1.

При анализе семян подсолнечника пробу дополнительно очищают на концентрирующем патроне Sep Pak Silica по п. 9.1.2.2.

9.1.2.2. Очистка экстракта семян подсолнечника на концентрирующих патронах Sep Pak Silica

Полученный по п. 9.1.2.1 раствор вносят с помощью медицинского шприца на сухой концентрирующий патрон Sep Pak Silica (подготовленный по п. 7.9) со скоростью пропускания раствора 1 - 2 капли в сек. Колбу ополаскивают 2 куб. см хлористого метилена, который также наносят на патрон. После нанесения пробы патрон промывают 5 куб. см смеси хлористый метилен-этилацетат (1:1, по объему), затем 5 куб. см этилацетата, элюат отбрасывают. Вещества элюируют с патрона 15 куб. см 2%-ного раствора уксусной кислоты в этилацетате, собирая элюат в круглодонную колбу, упаривают при температуре не выше 40 °С досуха. Остаток растворяют в 4 куб. см подвижной фазы, подготовленной по п. 7.10.1, и анализируют содержание имазамокса по п. 9.3.1, имазапира - 9.3.2.

9.2.1. Экстракция

Образец масла массой 20 г помещают в коническую колбу вместимостью 200 - 250 куб. см, растворяют в 100 куб. см гексана, переносят в делительную воронку вместимостью 500, добавляют 100 куб. см смеси для экстракции (смесь ацетонитрил-вода, 1:1, с добавлением 2% ледяной уксусной кислоты), приготовленной по п. 7.4. Воронку интенсивно встряхивают 2 мин. После полного разделения фаз нижний слой осторожно декантируют через бумажный фильтр, помещенный в конусную воронку, в мерный цилиндр вместимостью 250 куб. см с пришлифованной пробкой, доливают водой до 200 куб. см. Раствор перемешивают и помещают в холодильник (4 - 6 °С) на 20 - 30 мин. (раствор при этом мутнеет). Измеряют объем раствора, 1/5 его часть, эквивалентную 4 г масла (около 40 куб. см), переносят в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см, упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °С до объема 8 - 10 куб. см. Очищают на концентрирующих патронах C18 Sep Pak по п. 9.1.2.1.

Жидкостной хроматограф с ультрафиолетовым детектором (фирмы Perkin-Elmer, США)

Колонка стальная длиной 25 см, внутренним диаметром 4 мм, содержащая Кромасил 100 С18, зернением 7 мкм.

Температура колонки: комнатная

Скорость потока элюента: 1 куб. см/мин.

Рабочая длина волны: 240 нм

Объем вводимой пробы: 20 мм

Чувствительность: 0,01 ед. абсорбции на шкалу.

9.3.1. Определение имазамокса и имазапира в семенах сои, растительных маслах, имазамокса - семенах подсолнечника

Подвижная фаза: ацетонитрил-вода-орто-фосфорная кислота (22:78:0,1, по объему)

9.3.2. Определение имазапира в семенах подсолнечника

Подвижная фаза: ацетонитрил-метанол-вода-орто-фосфорная кислота (16:2:82:0,1, по объему)

Ориентировочное время выхода имазапира: около 8 мин.

Линейный диапазон детектирования 2 - 20 нг.

Образцы, дающие пики большие, чем градуировочный раствор с концентрацией 1,0 мкг/куб. см, разбавляют подвижной фазой, приготовленной по п. 7.10.1, не более чем в 50 раз.

Содержание имазамокса и имазапира в пробе (Х, мг/кг) рассчитывают по формуле:

где:

С - концентрация имазамокса (имазапира), найденная по градуировочному графику в соответствии с величиной площади хроматографического пика, мкг/куб. см;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;

m - масса анализируемого образца, г;

К = 5, с учетом объема экстракта, взятого для анализа.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

Результат анализа представляют в виде:

где дельта - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, таблица 1), %.

Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание имазамокса (имазапира) в пробе менее 0,1 мг/кг" <*>.

--------------------------------

<*> 0,1 мг/кг - предел обнаружения.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

ФГУН "Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана" Роспотребнадзор.