"МУК 4.1.2477-09. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств амидосульфурона в масле кукурузы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 09.02.2009)

1. Разработаны Всероссийским НИИ защиты растений.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 25 декабря 2008 г. N 3).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 9 февраля 2009 г.

4. Введены в действие с 29 апреля 2009 г.

5. Введены впервые.

Настоящие Методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации амидосульфурона в масле кукурузы в диапазоне концентраций 0,05 - 0,5 мг/кг.

Название вещества по ИСО: Амидосульфурон.

Название вещества по ИЮПАК: 3-(4,6-диметоксипиримидин-2-ил)-1-[(N-метил-N-метилсульфонил)аминосульфонил]-мочевина.

Структурная формула (не приводится).

Амидосульфурон нетоксичен для птиц, рыб, земляных червей, почвенных микроорганизмов и пчел.

Гигиенические нормативы для амидосульфурона в России:

ДСД - 0,3 мг/кг массы тела человека; МДУ в масле кукурузы - 0,1 мг/кг.

Область применения

Амидосульфурон - избирательный гербицид системного действия из класса сульфонилмочевин. Механизм его действия связан с подавлением биосинтеза аминокислот с разветвленной цепью (валин, изолицин), приводящего к прекращению клеточного деления и роста. Эффективно уничтожает однолетние и многолетние двудольные сорные растения, в т.ч. устойчивые к 2,4-Д и 2М-4Х, в посевах зерновых культур, кукурузы, льна и посадках картофеля. Избирательность действия амидосульфурона обусловлена повышенной скоростью его детоксикации в устойчивых видах. Применяется в России в качестве гербицида в составе смесевых препаратов на посевах зерновых колосовых культур, кукурузы и льна-долгунца с нормой расхода 5 - 10 г д.в./га.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 2.

Методика основана на определении амидосульфурона с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовым детектором. Контроль амидосульфурона в образцах кукурузного масла осуществляется по содержанию вещества после извлечения его из масла ацетонитрилом, очистки экстракта путем распределения действующего вещества между несмешивающимися растворителями при щелочных и кислых значениях pH и на колонке с силикагелем.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичной или более высокой квалификацией.

Допускается применение другого оборудования с аналогичными или лучшими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими веществами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостной хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда по ГОСТ 12.0.004.

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на жидкостном хроматографе.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией "лаборант", имеющего опыт работы в химической лаборатории.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °С и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление растворов, подвижной фазы для ВЭЖХ, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики, подготовка колонки с силикагелем.

7.1.1. Очистка ацетонитрила. Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора не менее 1 ч, после чего перегоняют. Непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия.

7.1.2. Очистка н-гексана. Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до прекращения окрашивания ее в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над поташом.

7.1.3. Очистка силикагеля. Силикагель 60 (0,063 - 0,20 мм) для колоночной хроматографии встряхивают с двойным объемом очищенного ацетона и затем фильтруют на воронке Бюхнера через бумажный фильтр. Силикагель на фильтре промывают 1,5 объемом ацетона и затем высушивают при температуре 130 °С в течение 5 ч.

Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 8 - 10 мм уплотняют тампоном из стекловаты, медленно выливают в колонку (при открытом кране) суспензию 5 г силикагеля I степени активности в 20 куб. см гексана. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку последовательно промывают 20 куб. см смеси гексан - ацетон (1:9, по объему) и 30 куб. см смеси гексан - ацетон (2:3, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в секунду, после чего она готова к работе.

В круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 0,1 куб. см градуировочного раствора N 1 амидосульфурона с концентрацией 10 мкг/куб. см в ацетонитриле (п. 7.8.2), раствор упаривают досуха, остаток растворяют в 3 куб. см смеси гексан - ацетон (2:3, по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на колонку, подготовленную по п. 7.4. Промывают колонку 30 куб. см смеси гексан - ацетон (2:3, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в секунду, элюат отбрасывают. Затем колонку промывают 100 куб. см смеси гексан - ацетон (1:9, по объему). Фракционно (по 10 куб. см) отбирают элюат, упаривают, остатки растворяют в 1 куб. см ацетонитрила, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., вносят 1 куб. см подвижной фазы, подготовленной по п. 7.6, перемешивают и анализируют на содержание амидосульфурона по п. 9.4. Фракции, содержащие амидосульфурон, объединяют и вновь анализируют по п. 9.4. Рассчитывают содержание вещества в элюате, определяют полноту смывания с колонки и необходимый для очистки объем элюента.

Примечание. Профиль вымывания амидосульфурона может меняться при использовании новой партии сорбента и растворителей.

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 450 куб. см ацетонитрила, 10 куб. см метанола и 540 куб. см 0,005 М водного раствора орто-фосфорной кислоты (п. 7.2), перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр.

Промывают колонку подвижной фазой (приготовленной по п. 7.6) при скорости подачи растворителя 1 куб. см/мин. не менее часа до установления стабильной базовой линии.

7.8.1. Исходный раствор амидосульфурона для градуировки (концентрация 100 мкг/куб. см). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 0,010 г амидосульфурона, растворяют в 40 - 50 куб. см ацетонитрила, доводят ацетонитрилом до метки, тщательно перемешивают.

Раствор хранят в морозильной камере при температуре не выше - 18 °С в течение месяца.

7.8.2. Раствор амидосульфурона N 1 для градуировки (концентрация 10 мкг/куб. см). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 10 куб. см исходного раствора амидосульфурона с концентрацией 100 мкг/куб. см (п. 7.8.1), разбавляют ацетонитрилом до метки. Этот раствор используют для приготовления рабочих градуировочных растворов N 2 - 5.

Для приготовления проб масла с внесением при оценке полноты извлечения амидосульфурона из исследуемых образцов используют ацетоновый раствор амидосульфурона с концентрацией 5 мкг/куб. см.

Градуировочный раствор N 1 хранят в морозильной камере при температуре не выше - 18 °С в течение месяца.

7.8.3. Рабочие растворы N 2 - 5 амидосульфурона для градуировки (концентрация 0,05 - 0,5 мкг/куб. см). В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают 0,5; 1,0; 2,5 и 5,0 куб. см градуировочного раствора N 1 амидосульфурона с концентрацией 10 мкг/куб. см (п. 7.8.2), доводят до метки подвижной фазой, приготовленной по п. 7.6, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 2 - 5 с концентрацией амидосульфурона 0,05; 0,10; 0,25 и 0,5 мкг/куб. см соответственно.

Растворы готовят непосредственно перед использованием.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость высоты пика (мм) от концентрации амидосульфурона в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4-м растворам для градуировки.

В инжектор хроматографа вводят по 50 куб. мм каждого градуировочного раствора (п. 7.8.3) и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.4. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79) и правилами, определенными ГОСТ 10852-86 "Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб".

Масло хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике при температуре не выше 4 °С не более 3 месяцев. В некоторых случаях масло получают из зерна кукурузы экстракцией органическими неполярными растворителями (петролейный и диэтиловый эфиры) непосредственно перед проведением анализа.

Образец масла массой 10 г вносят в делительную воронку вместимостью 100 куб. см, добавляют 30 куб. см ацетонитрила и содержимое интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После разделения фаз ацетонитрильный слой собирают в делительную воронку вместимостью 250 куб. см. Операцию экстракции масляной фазы повторяют еще два раза, используя по 25 куб. см ацетонитрила. Дальнейшую очистку объединенной ацетонитрильной фазы проводят по п. п. 9.2 и 9.3.

Сухой остаток в колбе, полученный по п. 9.2, растворяют в 1,8 куб. см ацетона, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., добавляют 1,2 куб. см гексана, перемешивают, вновь помещают в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на колонку с силикагелем, подготовленную по п. 7.4. Колбу обмывают 5 куб. см смеси гексан - ацетон (2:3, по объему), которые также наносят на колонку. Колонку промывают 25 куб. см смеси гексан - ацетон (2:3, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в секунду, элюат отбрасывают. Амидосульфурон элюируют с колонки 100 куб. см смеси гексан - ацетон (1:9, по объему), отбрасывая первые 20 куб. см элюата и собирая последующие 80 куб. см элюата непосредственно в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. Раствор упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре 30 °С. Сухой остаток растворяют в 1 куб. см подвижной фазы для ВЭЖХ, подготовленной по п. 7.6, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., и анализируют на содержание амидосульфурона по п. 9.4.

Жидкостной хроматограф с ультрафиолетовым детектором (фирма Knauer, Германия)

Колонка стальная длиной 15 см, внутренним диаметром 4 мм, содержащая Диасфер 110-С18, зернением 5 мкм

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор с концентрацией 0,5 мкг/куб. см, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

Альтернативная неподвижная фаза: Hipersil ODS, колонка длиной 25 см и внутренним диаметром 4,6 мм

Содержание амидосульфурона рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе "менее нижней границы определения"

< 0,05 мг/кг для кукурузного масла <*>.

--------------------------------

<*> 0,05 мг/кг - предел обнаружения для масла кукурузы.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):