"МУК 4.1.2164-07. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств дифеноконазола в картофеле, моркови и томатах методом капиллярной газожидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 15.02.2007)

1. Методические указания подготовлены Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана при участии специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко.

4. Введены впервые.

Настоящие Методические указания устанавливают метод капиллярной газожидкостной хроматографии для определения массовой концентрации дифеноконазола в клубнях картофеля, корнеплодах моркови и плодах томата в диапазоне 0,02 - 0,2 мг/кг.

Дифеноконазол - действующее вещество гербицида Скор, КЭ (250 г/л), фирма-производитель Сингента Кроп Протекшн АГ (Швейцария).

4-хлорфениловый эфир cis,trans-3-хлор-4-[4-метил-2-(1H-1,2,4-триазол-1-илметил)-1,3-диоксолан-2-ил]фенила (ИЮПАК).

1-[2-[4-(4-хлорфенокси)-2-хлорфенил]-4-метил-1,3-диоксолан-2-илметил]-1H-1,2,4-триазол (С.А.).

Структурная формула (не приводится).

Гигиенические регламенты применения дифеноконазола: ОДК в почве - 0,1 мг/кг; ПДК в воде водоемов - 0,001 мг/куб. дм; МДУ в свекле сахарной, яблоках и грушах - 0,1 мг/кг, в зерне хлебных злаков - не допускается в пределах чувствительности метода контроля. ВМДУ в картофеле, моркови и томатах - 0,1 мг/кг.

Область применения препарата

Дифеноконазол - системный фунгицид и протравитель семян. Обладает длительным защитным и лечебным действием против широкого круга растительных патогенов из классов аскомицетов, базидиомицетов, дейтеромицетов, включая возбудителей альтернариоза, септориоза, церкоспороза, парши, антракноза, ржавчины, мучнистой росы, а также некоторых патогенов, обитающих на семенах пшеницы, сахарной свеклы, картофеля, семечковых плодовых и овощных культур.

Зарегистрирован в России под торговым названием Скор, КЭ (250 г/л) в качестве средства борьбы с возбудителями парши, мучнистой росы и церкоспороза на посадках яблони, груши и посевах сахарной свеклы с нормой расхода препарата 0,15 - 0,4 кг/га. В настоящее время препарат проходит регистрационные испытания в качестве фунгицида на посадках картофеля и томатов, посевах моркови.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в таблице 2.

Методика основана на определении вещества с помощью капиллярной газожидкостной хроматографии (ГЖХ) с электронозахватным детектором (ЭЗД). Контроль дифеноконазола в матрицах осуществляется по содержанию вещества после экстракции его из растительного материала ацетоном, очистки экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей, а также на колонке с силикагелем и концентрирующем патроне Диапак-диол.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичной или более высокой квалификацией.

Допускается применение другого оборудования с аналогичными или лучшими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя с опытом работы на газовом хроматографе.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией "лаборант", имеющего опыт работы в химической лаборатории.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °С и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики, подготовка колонки с силикагелем и концентрирующих патронов Диапак-диол.

7.1.1. Очистка н-гексана

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до прекращения окрашивания последней в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над поташом.

7.1.2. Очистка этилацетата

Этилацетат промывают последовательно 5%-ным водным раствором карбоната натрия, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над безводным карбонатом калия и перегоняют.

7.1.3. Очистка ацетона

7.1.4. Очистка силикагеля

Силикагель I степени активности встряхивают с двойным объемом очищенного ацетона и затем фильтруют на воронке Бюхнера через бумажный фильтр. Силикагель на фильтре промывают 1,5 объемом ацетона и затем высушивают при температуре 130 °С в течение 3 часов.

Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 8 - 10 мм уплотняют тампоном из стекловаты, медленно выливают в колонку (при открытом кране) суспензию: 3 г силикагеля I степени активности в 15 куб. см гексана. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку промывают 15 куб. см смеси гексан - этилацетат (7:3, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в сек., после чего она готова к работе.

Концентрирующий патрон Диапак-диол промывают последовательно с помощью медицинского шприца 10 куб. см ацетона и 6 куб. см смеси гексан - ацетон (8:2, по объему) со скоростью 5 куб. см/мин.

В круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 0,2 куб. см градуировочного раствора N 1 дифеноконазола с концентрацией 2 мкг/куб. см в смеси гексан - ацетон (8:2, по объему) (п. 7.5.2). Отдувают растворитель током теплого воздуха, остаток растворяют в 2 куб. см смеси гексан - этилацетат (7:3, по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на колонку с силикагелем, подготовленную по п. 7.2. Промывают колонку 30 куб. см смеси гексан - этилацетат (1:1, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в сек., элюат отбрасывают. Затем колонку с силикагелем промывают 40 куб. см смеси гексан - этилацетат (3:7, по объему). Фракционно (по 5 куб. см) отбирают элюат, упаривают, остатки растворяют в 1 куб. см смеси гексан - ацетон (8:2, по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., и анализируют на содержание дифеноконазола по п. 9.5.

Капиллярную кварцевую колонку НР-1 (типа SE-30) устанавливают в термостат хроматографа и, не подсоединяя к детектору, кондиционируют при температуре 280 °С и скорости газа-носителя 2 куб. см/мин. в течение 8 - 10 часов.

7.5.1. Исходный раствор дифеноконазола для градуировки (концентрация 100 мкг/куб. см)

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 0,010 г дифеноконазола, растворяют в 40 - 50 куб. см смеси гексан - ацетон (8:2, по объему), доводят объем раствора этой же смесью до метки, тщательно перемешивают.

Раствор хранят в морозильной камере при температуре не выше -18 °С в течение 3-х месяцев.

7.5.2. Раствор дифеноконазола N 1 для градуировки (концентрация 2 мкг/куб. см)

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 2 куб. см исходного раствора дифеноконазола с концентрацией 100 мкг/куб. см (п. 7.5.1), разбавляют смесью гексан - ацетон (8:2, по объему) до метки. Этот раствор используют для приготовления рабочих градуировочных растворов N 2 - 5.

Для приготовления проб плодов и корнеплодов с внесением при оценке полноты извлечения дифеноконазола из исследуемых образцов используют ацетоновый раствор дифеноконазола с концентрацией 1 мкг/куб. см.

Градуировочный раствор N 1 и ацетоновый раствор дифеноконазола хранят в морозильной камере при температуре не выше -18 °С в течение месяца.

7.5.3. Рабочие растворы N 2 - 5 дифеноконазола для градуировки (концентрация 0,02 - 0,2 мкг/куб. см)

В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают 1,0; 2,0; 5,0 и 10,0 куб. см градуировочного раствора N 1 дифеноконазола с концентрацией 2 мкг/куб. см (п. 7.5.2), доводят до метки смесью гексан - ацетон (8:2, по объему), тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 2 - 5 с концентрацией дифеноконазола 0,02; 0,04; 0,1 и 0,2 мкг/куб. см соответственно.

Растворы готовят непосредственно перед использованием.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (мВ х с) от концентрации дифеноконазола в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки.

В инжектор хроматографа вводят по 1 куб. мм каждого градуировочного раствора (п. 7.5.3) и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.5. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79) и правилами, определенными ГОСТами 1725-85 "Томаты свежие", 1721-85 "Морковь столовая, свежая, заготавливаемая и поставляемая. Технические условия", 51808-2001 "Картофель свежий продовольственный, реализуемый в розничной торговой сети. Технические условия", 7176-85 "Картофель свежий, продовольственный, заготовляемый и поставляемый. Технические условия", 26832-86 "Картофель свежий для переработки на продукты питания. Технические условия", 6014-68 "Картофель свежий для переработки. Технические условия".

Пробы клубней картофеля, корнеплодов моркови и плодов томата хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике не более одного дня; для длительного хранения пробы замораживают и хранят при температуре -18 °С до анализа.

Перед анализом образцы измельчают ножом или на терке.

9.1.1. Плоды, корнеплоды, клубни. Образец измельченного растительного материала массой 25 г помещают в стакан гомогенизатора вместимостью 500 куб. см, добавляют 100 куб. см ацетона и гомогенизируют 3 мин. при 10000 об./мин. Раствор (с осадком) фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу вместимостью 250 куб. см. Осадок на фильтре промывают 50 куб. см ацетона. Экстракт и промывную жидкость переносят в химический стакан, перемешивают, измеряют объем раствора. Отбирают 1/5 объема экстракта (эквивалентна 5 г образца), переносят в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см и добавляют 30 куб. см деионизованной воды. Далее проводят очистку экстракта по п. 9.2.

Экстракт, полученный по п. 9.1.1 и помещенный в круглодонную колбу, упаривают на ротационном вакуумном испарителе до водного остатка (10 - 20 куб. см) при температуре не выше 40 °С. К водному остатку прибавляют 10 куб. см деионизованной воды, 15 куб. см насыщенного раствора хлорида натрия, перемешивают и переносят в делительную воронку вместимостью 100 куб. см. В воронку вносят 30 куб. см смеси гексан - диэтиловый эфир (4:1, по объему), интенсивно встряхивают в течение 2-х мин. После разделения фаз верхний органический слой фильтруют через слой безводного сульфата натрия в круглодонную колбу вместимостью 150 куб. см. Операцию экстракции водной фазы повторяют еще дважды, используя по 25 куб. см смеси гексан - диэтиловый эфир (4:1). Объединенную органическую фазу, пропущенную через слой сульфата натрия, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре 30 °С и подвергают дополнительной очистке на колонке с силикагелем по п. 9.3 и концентрирующем патроне Диапак-диол по п. 9.4.

Сухой остаток в круглодонной колбе, полученный по п. 9.2, растворяют в 0,9 куб. см этилацетата, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., добавляют 2,1 куб. см гексана, перемешивают, вновь помещают в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на колонку, подготовленную по п. 7.2. Колбу обмывают 2 куб. см смеси гексан - этилацетат (7:3, по объему), которые также наносят на колонку. Промывают колонку 30 куб. см смеси гексан - этилацетат (1:1, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в сек., элюат отбрасывают. Дифеноконазол элюируют с колонки 35 куб. см смеси гексан - этилацетат (3:7, по объему), собирая элюат непосредственно в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. Раствор упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре 30 °С. Сухой остаток экстракта клубней картофеля и плодов томата растворяют в 5 куб. см смеси гексан - ацетон (8:2, по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., и анализируют на содержание дифеноконазола по п. 9.5. Экстракт корнеплодов моркови дополнительно очищают с помощью концентрирующего патрона Диапак-диол.

Сухой остаток экстракта корнеплодов моркови в круглодонной колбе, полученный по п. 9.3, растворяют при помощи ультразвуковой ванны в 2 куб. см смеси гексан - ацетон (8:2, по объему) и переносят в подготовленный концентрирующий патрон Диапак-диол (п. 7.3). Патрон промывают 2,5 куб. см смеси гексан - ацетон (8:2, по объему), элюат отбрасывают. Дифеноконазол элюируют 9 куб. см смеси гексан - ацетон (7:3, по объему) в круглодонную колбу вместимостью 25 куб. см. Раствор упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 30 °С. Остаток в колбе растворяют в 5 куб. см смеси гексан - ацетон (8:2, по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., и анализируют на содержание дифеноконазола по п. 9.5.

Колонка капиллярная кварцевая НР-1 (типа SE-30), длина 5 м, внутренний диаметр 0,53 мм, толщина пленки 0,88 мкм, фирма Хьюлетт-Паккард (США).

Температура термостата испарителя - 270 °С, детектора - 320 °С, термостата колонки - 245 °С.

Расход газов: газа-носителя (азот) - 2,5 куб. см/мин.; поддувочного газа через детектор - 25 куб. см/мин.

Деление потока: 1:2.

Время удерживания дифеноконазола: 3 мин. 35 сек.

Объем вводимой пробы: 1 куб. мм.

Линейный диапазон детектирования: 0,02 - 0,4 нг.

Каждую анализируемую пробу вводят 3 раза и вычисляют среднюю площадь хроматографического пика дифеноконазола.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор с концентрацией 2,0 мкг/куб. см, разбавляют смесью гексан - ацетон (8:2).

Содержание дифеноконазола рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе "менее нижней границы определения" менее 0,02 мг/кг для корнеплодов, плодов и клубней <*>.

--------------------------------

<*> 0,02 мг/кг - предел обнаружения для корнеплодов, плодов и клубней.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

ГНУ ВНИИ фитопатологии.