"МУК 4.1.2332-08. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств флудиоксонила в семенах и масле рапса, ягодах и соке винограда методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 15.02.2008)

1. Разработаны Всероссийским НИИ защиты растений.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по защите прав потребителей и благополучия человека (протокол от 6 декабря 2007 г. N 3).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 15 февраля 2008 г.

4. Введены в действие с 10 апреля 2008 г.

5. Введены впервые в качестве дополнения.

Настоящие Методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации флудиоксонила в семенах и масле рапса, ягодах и соке винограда в диапазоне 0,02 - 0,2 мг/кг.

Название вещества по ИСО: Флудиоксонил.

Название вещества по ИЮПАК: 4-(2,2-дифтор-1,3-бензодиоксол-4-ил)-пиррол-3-карбонитрил.

Структурная формула (не приводится).

Рекомендуемый норматив для флудиоксонила в рапсе (семена и масло) и винограде (ягоды, сок) - 0,05 мг/кг.

Область применения

Флудиоксонил - контактный фунгицид широкого спектра действия с продолжительной активностью. Высокоэффективен против снежной плесени, твердой головни, гельминтоспориозной и фузариозной корневых гнилей на зерновых злаках, а также ризоктониоза, склеротиниоза, серой гнили и альтернариоза на винограде, косточковых плодовых, овощных и декоративных культурах.

Применяется в России в качестве фунгицида для предпосевного протравливания семян зерновых культур, гороха, подсолнечника и сахарной свеклы, а также для обработки клубней картофеля перед закладкой на хранение с нормой расхода от 5 до 125 г д.в./т.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в таблице 2.

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Методика основана на определении вещества с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовым детектором. Контроль флудиоксонила в матрицах осуществляется по содержанию вещества после экстракции его из семян и масла ацетонитрилом, из ягод - ацетоном, из сока - смесью гексана и диэтилового эфира, очистки экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей, а также на колонке с силикагелем и концентрирующем патроне Диапак С8.

Идентификация проводится по времени удерживания, количественное определение - методом абсолютной калибровки.

В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Избирательность обеспечивается подбором колонки и состава подвижной фазы.

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичной или более высокой квалификацией.

Допускается применение другого оборудования с аналогичными или лучшими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостной хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на жидкостном хроматографе.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией "лаборант", имеющего опыт работы в химической лаборатории.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 + 5) °С и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление растворов, подвижной фазы для ВЭЖХ, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики, подготовка колонки с силикагелем и концентрирующего патрона Диапак С8.

7.1.1. Очистка н-гексана

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до прекращения ее окрашивания в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над поташом.

7.1.2. Очистка этилацетата

Этилацетат промывают последовательно 5%-ным водным раствором карбоната натрия, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над безводным карбонатом калия и перегоняют.

7.1.3. Очистка диэтилового эфира

Растворитель предварительно встряхивают со свежеприготовленным раствором железного купороса, а затем последовательно промывают 0,5%-ным раствором перманганата калия, 5%-ным раствором гидроксида натрия и водой, после чего сушат над хлористым кальцием и перегоняют.

Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 8 - 10 мм уплотняют тампоном из стекловаты, медленно выливают в колонку (при открытом кране) суспензию 5 г силикагеля I степени активности в 20 куб. см гексана. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку последовательно промывают 20 куб. см смеси гексан - этилацетат (1:1, по объему) и 20 куб. см смеси гексан - этилацетат (8:2, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в сек., после чего она готова к работе.

Концентрирующий патрон Диапак С8 промывают последовательно с помощью медицинского шприца 7 куб. см ацетонитрила и 7 куб. см смеси ацетонитрил - вода (3:7, по объему) со скоростью 5 куб. см/мин.

В круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 0,1 куб. см градуировочного раствора N 1 флудиоксонила с концентрацией 10 мкг/куб. см в ацетонитриле (п. 7.6.2) и отдувают растворитель током азота. Остаток растворяют в 0,6 куб. см этилацетата, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., добавляют 2,4 куб. см гексана, перемешивают, вновь помещают в ультразвуковую баню на 1 мин. Раствор наносят на колонку, подготовленную по п. 7.2. Промывают колонку 100 куб. см смеси гексан - этилацетат (8:2, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в сек. Фракционно (по 10 куб. см) отбирают элюат, упаривают, остатки растворяют в 1 куб. см ацетонитрила, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., вносят 1 куб. см подвижной фазы, подготовленной по п. 7.4, перемешивают и анализируют на содержание флудиоксонила по п. 9.5.

Фракции, содержащие флудиоксонил, объединяют, упаривают досуха, остаток растворяют в 20 куб. см подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 7.4) и вновь анализируют по п. 9.5. Рассчитывают содержание вещества в элюате, определяют полноту смывания с колонки и необходимый для очистки объем элюента.

Примечание: Профиль вымывания флудиоксонила с колонки может меняться при использовании новой партии сорбента и растворителей.

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 500 куб. см ацетонитрила, 500 куб. см бидистиллированной воды, перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр.

Промывают колонку подвижной фазой (приготовленной по п. 7.4) при скорости подачи растворителя 1 куб. см/мин. не менее 2-х часов до установления стабильной базовой линии.

7.6.1. Исходный раствор флудиоксонила для градуировки (концентрация 100 мкг/куб. см). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 0,010 г флудиоксонила, растворяют в 40 - 50 куб. см ацетонитрила, доводят ацетонитрилом до метки, тщательно перемешивают.

Раствор хранят в морозильной камере при температуре не выше -18 °С в течение 3-х месяцев.

7.6.2. Раствор флудиоксонила N 1 для градуировки (концентрация 10 мкг/куб. см).

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 10 куб. см исходного раствора флудиоксонила с концентрацией 100 мкг/куб. см (п. 7.6.1), разбавляют ацетонитрилом до метки. Этот раствор используют для приготовления рабочих градуировочных растворов N 2 - 5.

Для приготовления проб семян, масла, ягод и сока с внесением при оценке полноты извлечения флудиоксонила из исследуемых образцов используют ацетоновый раствор флудиоксонила с концентрацией 10 мкг/куб. см.

Градуировочный раствор N 1 и ацетоновый раствор флудиоксонила хранят в морозильной камере при температуре не выше -18 °С в течение месяца.

7.6.3. Рабочие растворы N 2 - 5 флудиоксонила для градуировки (концентрация 0,05 - 0,5 мкг/куб. см).

В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают 0,5; 1,0; 2,5 и 5,0 куб. см градуировочного раствора N 1 флудиоксонила с концентрацией 10 мкг/куб. см (п. 7.6.2), доводят до метки подвижной фазой, приготовленной по п. 7.4, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 2 - 5 с концентрацией флудиоксонила 0,05; 0,1; 0,25 и 0,5 мкг/куб. см соответственно.

Растворы готовят непосредственно перед использованием.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость высоты пика (мм) от концентрации флудиоксонила в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки.

В инжектор хроматографа вводят по 20 куб. мм каждого градуировочного раствора (п. 7.6.3) и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.5. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79) и правилами, определенными ГОСТом 10852-86 "Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб", ГОСТом 8988-77 "Масло рапсовое. ТУ", ГОСТом 25896-83 "Виноград свежий столовый".

Пробы семян рапса высушивают до стандартной влажности и хранят в бумажных или тканевых мешочках в сухом, хорошо проветриваемом шкафу, недоступном для грызунов в течение 1 года.

Пробы масла хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике при температуре не выше 4 °С не более 30 дней. В некоторых случаях масло получают из семян рапса экстракцией органическими неполярными растворителями (петролейный и диэтиловый эфиры) непосредственно перед проведением анализа.

Пробы ягод анализируют в день отбора или замораживают и хранят в полиэтиленовой таре в морозильной камере при температуре не выше -18 °С.

Сок получают из ягод непосредственно перед проведением анализа. Перед анализом семена и ягоды измельчают с помощью кофемолки и гомогенизатора.

9.1.1. Семена. Образец размолотых семян рапса массой 10 г помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 куб. см, добавляют 100 куб. см ацетонитрила и помещают в ультразвуковую ванну на 5 мин. Суспензию фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу вместимостью 250 куб. см. Осадок на фильтре промывают 25 куб. см ацетонитрила. Экстракт и промывную жидкость, объединенные в мерном цилиндре, перемешивают, измеряют объем раствора и 1/2 его часть (эквивалентную 5 г образца) переносят в делительную воронку вместимостью 250 куб. см. К пробе приливают 20 куб. см гексана и смесь интенсивно встряхивают в течение 2-х минут. После разделения фаз нижний ацетонитрильный слой фильтруют в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см и затем упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре 40 °С. Далее проводят очистку экстракта по п. 9.2.

9.1.2. Масло. Образец масла массой 5 г вносят в делительную воронку вместимостью 100 куб. см, добавляют 50 куб. см метанола и воронку интенсивно встряхивают в течение 2-х мин. Эмульсию переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют 10 минут при 4000 об./мин. Метанольный слой декантируют в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. Операцию экстракции масляной фазы повторяют, используя 30 куб. см метанола. Объединенный метанольный экстракт упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре 30 °С. Дальнейшую очистку проводят по п. 9.2.

9.1.3. Ягоды. Навеску измельченного растительного материала массой 25 г помещают в стакан гомогенизатора вместимостью 500 куб. см, приливают 100 куб. см ацетона и гомогенизируют 3 минуты при 10000 об./мин. Суспензию фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу вместимостью 250 куб. см. Остаток на фильтре промывают 50 куб. см ацетона. Экстракт и промывную жидкость переносят в химический стакан, перемешивают, измеряют объем раствора. Отбирают 1/5 объема раствора (эквивалентную 5 г образца), переносят в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см и упаривают на ротационном вакуумном испарителе до водного остатка (1 - 2 куб. см) при температуре 40 °С. Дальнейшую очистку проводят по п. 9.2.

9.1.4. Сок. Навеску (20 г) свежевыжатого сока помещают в химический стакан, приливают 60 куб. см деионизованной воды, перемешивают, измеряют объем раствора. Отбирают 1/4 объема раствора (эквивалентную 5 г образца), переносят в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см и упаривают на ротационном вакуумном испарителе до водного остатка (2 - 3 куб. см) при температуре 40 °С. Далее проводят очистку экстракта по п. 9.2.

Остатки экстрактов, полученных по п. п. 9.1.1, 9.1.2, 9.1.3 и 9.1.4, растворяют в 30 куб. см смеси ацетонитрил - вода (3:7, по объему) и переносят в делительную воронку вместимостью 100 куб. см. Прибавляют 30 куб. см смеси гексан - диэтиловый эфир (4:1, по объему) и воронку интенсивно встряхивают в течение 2-х мин. После разделения фаз верхний органический слой отделяют, фильтруют через слой безводного сульфата натрия, помещенный на бумажный фильтр в конусной воронке, в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. Операцию экстракции водно-ацетонитрильной фазы повторяют еще дважды, используя по 20 куб. см смеси гексан - диэтиловый эфир (4:1, по объему). Объединенную органическую фазу, пропущенную через слой сульфата натрия, упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 30 °С.

Сухой остаток в круглодонной колбе, полученный по п. 9.2, растворяют в 0,6 куб. см этилацетата, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., добавляют 2,4 куб. см гексана, перемешивают, вновь помещают в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на колонку, подготовленную по п. 7.2. Колбу обмывают 3 куб. см смеси гексан - этилацетат (8:2, по объему), которые также наносят на колонку. Промывают колонку 100 куб. см смеси гексан - этилацетат (8:2, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в сек., отбрасывают первые 45 куб. см элюата и собирают последующие 60 куб. см в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. Раствор упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре 40 °С и остаток подвергают дополнительной очистке на концентрирующем патроне Диапак С8 по п. 9.4.

Сухой остаток в круглодонной колбе, полученный по п. 9.3, растворяют в 0,9 куб. см ацетонитрила, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., добавляют 2,1 куб. см бидистиллированной воды, перемешивают, вновь помещают в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор вносят с помощью медицинского шприца на концентрирующий патрон Диапак С8, подготовленный по п. 7.2, со скоростью 1 - 2 капли в сек. После нанесения пробы патрон промывают 4 куб. см смеси ацетонитрил - вода (3:7, по объему), элюат отбрасывают. Флудиоксонил элюируют с патрона 4 куб. см смеси ацетонитрил - вода (6:4, по объему) в круглодонную колбу вместимостью 50 куб. см. Раствор упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре 40 °С. Остаток в колбе растворяют в 2 куб. см подвижной фазы для ВЭЖХ, подготовленной по п. 7.4, помещают в ультразвуковую ванну на 1 мин. и анализируют на содержание флудиоксонила по п. 9.5.

Жидкостной хроматограф с ультрафиолетовым детектором (фирмы Knauer, Германия).

Колонка стальная длиной 15 см, внутренним диаметром 4 мм, содержащая Диасфер 110-С18 (5 мкм).

Температура колонки: комнатная.

Подвижная фаза: ацетонитрил - вода (50:50, по объему).

Скорость потока элюента: 0,8 куб. см/мин.

Рабочая длина волны: 268 нм.

Чувствительность: 0,01 ед. абсорбции на шкалу.

Объем вводимой пробы: 20 куб. мм.

Ориентировочное время выхода флудиоксонила: 9,6 - 10,2 мин.

Линейный диапазон детектирования: 1 - 20 нг.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор с концентрацией 0,5 мкг/куб. см, разбавляют подвижной фазой, приготовленной по п. 7.4.

Альтернативная подвижная фаза: Диасорб 130-С16.

Ориентировочное время выхода флудиоксонила: 8,8 - 9,3 мин.

Содержание флудиоксонила рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе "менее нижней границы определения"

< 0,02 мг/кг для семян и масла рапса, ягод и сока винограда <*>.

--------------------------------

<*> 0,02 мг/кг - предел обнаружения для рапса и винограда.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):