"МУК 4.1.2381-08. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств гимексазола в воде, ботве и корнеплодах сахарной свеклы методом газожидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 02.07.2008)

1. Разработаны Российским государственным аграрным университетом - МСХА им. К.А. Тимирязева, Учебно-научный консультационный центр "Агроэкология пестицидов и агрохимикатов".

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 3 апреля 2008 г. N 1).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 2 июля 2008 г.

4. Введены в действие с 3 сентября 2008 г.

5. Введены впервые.

Настоящие Методические указания устанавливают метод газожидкостной хроматографии для определения массовой концентрации Гимексазола в воде в диапазоне 0,001 - 0,05 мг/куб. дм; а также уровня остаточных количеств в ботве и корнеплодах сахарной свеклы в диапазоне 0,01 - 0,1 мг/кг.

Название действующего вещества по ИСО: Гимексазол.

Название действующего вещества по ИЮПАК: 5-метилизоксазол-3-ол.

Структурная формула (не приводится).

Молекулярная масса 99,08.

Агрегатное состояние: игольчатые кристаллы.

Цвет, запах: бесцветный, без запаха.

Давление насыщенного пара: 182 мПа при 25 °С.

Растворимость в воде при 20 °С - 58,2 - 67,8 мг/куб. дм (pH 3 - 9).

Растворимость в органических растворителях, г/куб. дм: ацетоне - 730; дихлорметане - 602; этилацетате - 437; н-гексане - 12,2.

Вещество термо- и фотостабильно, слабо разрушается под действием кислот и щелочей. В почве превращается в 5-метил-2-(3H)-оксазолон с периодом полураспада 2 - 25 дней.

В России установлены следующие гигиенические нормативы: ДСД 0,01 мг/кг/сут., ПДК в воде 0,002 мг/л. Остаточные количества Гимексазола в свекле, горохе и рисе не допускаются.

Гимексазол - системный фунгицид, подавляющий возбудителей заболеваний растений, инфекционное начало которых находится в и на семенах. Фунгицид рекомендуется для обработки семян сахарной свеклы против корнееда всходов с нормой расхода 4 - 5 кг д.в./т.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в таблице 2.

Метод основан на газохроматографическом определении Гимексазола с использованием термоионного детектора на фосфор после экстракции его из матрицы органическим растворителем, перераспределения между двумя несмешивающимися растворителями, дериватизации Гимексазола до эфира О,О-диэтилтиофосфорной кислоты и очистки продукта дериватизации на колонке с Флоризилом.

Идентификация проводится по времени удерживания. Количественное определение - методом абсолютной калибровки.

В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Избирательность обеспечивается путем подбора колонки и условий программирования температуры. Определению Гимексазола методом ГЖХ могут мешать коэкстрактивные вещества фенольного типа, извлекаемые из корнеплодов сахарной свеклы после их длительного хранения. Поэтому рекомендуется проводить контроль за содержанием остаточных количеств Гимексазола в образцах сахарной свеклы сразу после ее уборки.

Весы аналитические "OHAUS", СИГМА 11140.

Весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания до 600 г и пределом допустимой погрешности +/- 0,038 г "ACCULAB" V600.

Колбы мерные на 25, 50, 100 куб. см, ГОСТ 1770-74.

Микрошприц на 10 куб. мм, ТУ 2.833.106.

Пипетки мерные на 1,0; 2,0; 5,0 куб. см, ГОСТ 20292-74.

Цилиндры мерные на 10, 25 и 50 куб. см, ГОСТ 1770-74.

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Аналитический стандарт Гимексазола, фирма Санкио с содержанием д.в. 98,4%.

Азот особой чистоты, ГОСТ 9293-74.

Аммиак, водный, чда, ГОСТ 3760-79.

Ацетон, хч, ГОСТ 2603-71.

Вода дистиллированная, ГОСТ 7602-72.

н-Гексан, ч, ТУ 6-09-3375-78.

Диэтиловый эфир, хч, ГОСТ 6265-74.

Диэтилхлортиофосфат, 97%-ный, Aldrich Chemical Co., Inc. (Высокотоксичен! Чувствителен к действию влаги. Соблюдать осторожность при работе!).

Диэтилхлортиофосфат, 0,2%-ный раствор в ацетоне.

Калий углекислый, ч., ГОСТ.

Калий углекислый, 25%-ный водный раствор.

Натрий сернокислый, б/в, чда, ГОСТ 4166-76.

Натрий хлористый, чда, ГОСТ 4233-77.

Полиэтиленгликоль, 1%-ный раствор в эфире.

Соляная кислота, ч, ГОСТ 3118-77.

Соляная кислота, 2 н водный раствор.

Флоризил для колоночной хроматографии с размером частиц 60 - 80 меш, фирма "Агрос Органикс", Бельгия, код 205450010.

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичной или более высокой классификации.

Аппарат для встряхивания проб "SKLO UNION TYP LT1".

Баня водяная, ТУ 46-22-603-75.

Банки с крышками для экстракции на 250 куб. см, полипропилен, кат. N 3120-0250, NALGENE.

Воронки делительные на 250 куб. см, ГОСТ 10054-75.

Воронки химические для фильтрования стеклянные, ГОСТ 8613-75.

Испаритель ротационный Rotavapor R110 Buchi с водяной баней В-480, фирма Буши;

Колбы конические плоскодонные на 100 и 250 куб. см, КПШ-100, КПШ-250, ГОСТ 10394-72.

Концентраторы круглодонные на 250 куб. см, ГОСТ 10394-72.

Колонка хроматографическая стеклянная длиной 1 м, внутренним диаметром 3 мм, заполненная 5% OV-17 на Хроматоне N-AW-DMCS.

Колонка хроматографическая капиллярная кварцевая DB-1701 длиной 15 м с внутренним диаметром 0,32 мм, толщина пленки 0,25 мкм.

Насос диафрагменный FT.19 фирмы KNF Neu Laboport.

Фильтры бумажные "Красная лента", ТУ 6-09-1678-86.

Холодильник стеклянный лабораторный, XIIT, ГОСТ 9499-70.

Центрифуга MPW-350e с набором полипропиленовых банок емкостью 200 куб. см.

Допускается применение хроматографических колонок и другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на газовом хроматографе.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией "лаборант", имеющего опыт работы в химической лаборатории.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °С и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Готовую насадку (5% OV-17 на Хроматоне N-AW-DMCS или 5% SE-30 на Хроматоне N-AW) засыпают в стеклянную колонку, уплотняют под вакуумом, колонку устанавливают в термостате хроматографа, не подсоединяя к детектору, и стабилизируют в токе азота при температуре 280 °С.

7.3.1. Приготовление стандартных растворов

Взвешивают 50 мг Гимексазола в мерной колбе на 50 куб. см, растворяют навеску в ацетоне и доводят объем до метки ацетоном (стандартный раствор N 1 с концентрацией 1 мг/куб. см). Методом последовательного разведения готовят раствор в ацетоне с концентрацией 10 мкг/куб. см (стандартный раствор N 2).

Стандартные растворы N 1 и 2 можно хранить в холодильнике в течение 3 месяцев.

7.3.2. Дериватизация Гимексазола до О,О-диэтил-О-(5-метил-3-изоксазолил)-тиофосфата

Для получения калибровочных растворов отбирают в концентратор 1 куб. см стандартного раствора N 2 с концентрацией 10 мкг/куб. см в ацетоне, прибавляют 0,05 куб. см 25%-ного раствора углекислого калия, 2 куб. см 0,2%-ного раствора диэтилхлортиофосфата в ацетоне, 1 куб. см ацетона и плотно закрывают концентратор стеклянной пробкой. Концентратор помещают на водяной бане при температуре 45 °С и выдерживают в течение 15 минут. Внимание! Вещество очень летуче! Следить за герметичностью сосуда!

Вводят в хроматограф по 2,5 куб. мм каждого из полученных растворов, измеряют высоту пиков и строят график зависимости высоты пика от концентрации Гимексазола.

7.3.3. Приготовление калибровочных растворов

По окончании дериватизации сосуд охлаждают (концентрация Гимексазола в полученном растворе - 2,5 мкг/куб. см) и методом последовательного разбавления готовят стандартные растворы с концентрациями по Гимексазолу 1,25; 0,5; 0,25, 0,125 и 0,05 мкг/мл.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади (высоты) пика от концентрации Гимексазола в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 5-ти растворам для градуировки с концентрацией 1,25; 0,5; 0,25, 0,125 и 0,05 мкг/куб. см.

В испаритель хроматографа вводят по 1 или 2,5 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.3. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений.

По полученным данным строят градуировочный график зависимости площади хроматографического пика в мВ от концентрации Гимексазола в растворе в мкг/куб. см (рис. 1 - не приводится).

2.3.5. Подготовка колонки для очистки экстракта

В пластиковую или стеклянную колонку диаметром 15 мм помещают примерно 5 г Флоризила с размером зерен 60 - 100 меш и, аккуратно постукивая по стенкам колонки, формируют слой адсорбента высотой 5 см. Сверху на Флоризил насыпают 1 г безводного сульфата натрия. Колонку промывают последовательно 20 куб. см смеси гексана с ацетоном в соотношении 2:1 и 10 куб. см гексана и оставляют на сутки при комнатной температуре для высушивания.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" N 2051-79 от 21.08.79, а также в соответствии с ГОСТ Р 51592-2000 "Вода. Общие требования к отбору проб", ГОСТ 28736-90 "Корнеплоды кормовые".

Пробы воды хранят в герметично закрытой стеклянной таре в холодильнике при температуре 0 - 4 °С.

Пробы ботвы и корнеплодов свеклы хранят в холодильнике в полиэтиленовых пакетах при температуре 0 - 4 °С в течение до 3-х суток. Для длительного хранения пробы замораживают и хранят в морозильной камере при температуре -18 °С до 2-х лет.

Перед анализом корнеплоды размораживают и измельчают на терке. Ботву измельчают.

Помещают в делительную воронку 200 куб. см воды, подкисляют 2 н раствором соляной кислоты до pH 2 и добавляют 80 г (8 чайных ложек) хлорида натрия. Экстрагируют образец 100 куб. см диэтилового эфира путем встряхивания воронки в течение 2-х минут. Собирают органический слой в концентратор, пропуская его через безводный сульфат натрия. Водный слой вновь помещают в делительную воронку и экстракцию повторяют дважды с тем же объемом эфира (общий объем экстракта - 300 куб. см).

В концентратор с экстрактом приливают 1 куб. см 1%-ного раствора полиэтиленгликоля в диэтиловом эфире и упаривают растворитель на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 35 °С до объема 0,5 - 1 куб. см. Остаток растворителя удаляют током воздуха или азота при комнатной температуре. При нарушении режима упаривания возможны большие потери Гимексазола ввиду его высокой летучести. Данный режим упаривания необходимо соблюдать и при анализе Гимексазола в других средах.

К остатку в концентраторе добавляют 2 куб. см 0,2%-ного раствора диэтилхлортиофосфата в ацетоне и 0,05 куб. см 25%-ного раствора карбоната калия, плотно закрывают концентратор стеклянной пробкой и выдерживают пробу на водяной бане при температуре 45 °С в течение 15 минут. После охлаждения пробы добавляют в концентратор 2 куб. см ацетона и смесь перемешивают. Вводят в хроматограф 1,0 - 2,5 куб. мм пробы.

Образец корнеплодов сахарной свеклы массой 50 г (или 25 г зеленой массы) помещают в плоскодонную колбу емкостью 250 куб. см с пришлифованной пробкой, приливают 100 куб. см ацетона и экстрагируют Гимексазол на аппарате для встряхивания в течение 30 минут. Затем содержимое колбы фильтруют в концентратор через бумажный фильтр методом декантации. Повторяют процесс экстракции дважды, при этом для корнеплодов используют две порции по 100 куб. см ацетона, а для зеленой массы - по 50 куб. см. Экстракты объединяют в концентраторе. К объединенному экстракту добавляют 1 куб. см 25%-ного водного раствора углекислого калия и упаривают растворитель на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 35 °С. Водный остаток из концентратора переносят в делительную воронку, обмывают концентратор двумя порциями по 50 куб. см дистиллированной воды при анализе корнеплодов и по 25 куб. см при анализе зеленой массы. Добавляют в воронку 1 г двууглекислого натрия, 10 г хлористого натрия и смесь тщательно перемешивают. Прибавляют 100 куб. см диэтилового эфира и смесь встряхивают в воронке 1 - 2 минуты. Органический верхний слой отбрасывают. Очистку эфиром повторяют еще два раза, используя тот же объем растворителя. Водный раствор подкисляют в воронке 2 н раствором соляной кислоты до pH 2, добавляют 10 г твердого хлористого натрия и экстрагируют Гимексазол диэтиловым эфиром трижды порциями по 100 куб. см. Эфирный экстракт собирают в концентратор, пропуская его после разделения слоев в воронке через безводный сульфат натрия. Добавляют в концентратор 1 куб. см 1%-ного раствора полиэтиленгликоля в диэтиловом эфире и выпаривают растворитель досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 35 °С.

При анализе корнеплодов к остатку в концентраторе добавляют 2 куб. см 0,2%-ного раствора диэтилхлортиофосфата в ацетоне, 2 куб. см ацетона, 0,05 куб. см 25%-ного водного раствора углекислого калия, плотно закрывают концентратор стеклянной пробкой и выдерживают пробу на водяной бане при температуре 45 °С в течение 45 минут.

При анализе зеленой массы к остатку в концентраторе добавляют 2 куб. см 0,2%-ного раствора диэтилхлортиофосфата в ацетоне, 0,05 куб. см 25%-ного водного раствора углекислого калия, плотно закрывают концентратор стеклянной пробкой и выдерживают пробу на водяной бане при температуре 45 °С в течение 30 минут.

После охлаждения раствор из концентратора переносят на хроматографическую колонку с Флоризилом, подготовленную, как указано в разделе 2.3.5, и пропускают через колонку 6 куб. см гексана и 14 куб. см смеси гексана с ацетоном в соотношении 85:15. Элюат собирают в концентратор и выпаривают растворитель досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 35 °С.

Добавляют в концентратор при анализе корнеплодов 4 куб. см ацетона, а при анализе ботвы 2 куб. см и вводят в хроматограф 1 - 2,5 куб. мм пробы.

Набивные колонки.

Колонка стеклянная спиральная длиной 1 м, внутренний диаметр 3 мм, заполненная 5% OV-17 на Хроматоне N-AW-DMCS (0,16 - 0,20 мм).

Температура испарителя - 250 °С, термостата колонки - 165 °С, переходной камеры - 320 °С.

Газовый режим: азот - 30; водород - 14; воздух - 180 куб. см/мин.

Абсолютное время удерживания - 4 мин. 00 сек.

Объем вводимой пробы - 2,5 куб. мм.

Линейность детектирования сохраняется в пределах 0,1 - 5,0 нг.

Альтернативная фаза: 5% SE-30 на Хроматоне N-AW (0,20 - 0,25 мм), длина колонки 1 м.

Каждую анализируемую пробу вводят в хроматограф 3 раза и вычисляют среднюю высоту пика.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор с концентрациями Гимексазола 2 мкг/куб. см соответственно, разбавляют.

Капиллярные колонки.

Колонка капиллярная кварцевая, длина 15 м, внутренний диаметр 0,32 мм, жидкая фаза DB-1701.

Температура термостата колонки программированная. Начальная температура - 120 °С, выдержка 4 минуты; нагрев колонки по 4 градуса в минуту до температуры 160 °С, выдержка 5 минут; нагрев колонки - 40 градусов в минуту до температуры 200 °С, выдержка 5 минут.

Температура испарителя - 260 °С, детектора - 320 °С.

Газовый режим - Splitless.

Газ-носитель - гелий. Минимальный расход гелия - 20 куб. см/мин.; длительность сброса - 1 мин.

Газ 1 - гелий, расход - 0,5 куб. см/мин., линейная скорость - 21 см/сек., давление на входе - 26,01 кПа.

Газ 2 - гелий (продувка испарителя). Сброс 1:100, начало сброса - 5 сек., расход - 50 куб. см/мин.

Газ 3 - азот (поддув в детектор), расход во время анализа - 35 куб. см/мин.

Продувка системы после анализа при температуре 200 °С в течение 5 минут; продувка детектора азотом - 60 мл/мин.; продувка испарителя гелием - 60 куб. см/мин.

Расход водорода - 14 куб. см/мин., расход воздуха - 180 куб. см/мин.

Абсолютное время удерживания Гимексазола - 15 мин. 42 сек. - 15 мин. 50 сек.

Объем вводимой пробы - 1 куб. мм.

Линейность детектирования сохраняется в пределах 0,05 - 0,5 нг.

Образцы, дающие пики больше, чем стандартный раствор с концентрацией 0,5 мкг/куб. см, разбавляют.

Для обработки результатов хроматографического анализа используется программа сбора и обработки хроматографической информации "Хроматэк Аналитик", версия 1.20.

Альтернативная обработка результатов.

Содержание Гимексазола в пробах воды, зеленой массе и корнеплодах сахарной свеклы рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

дельта - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, таблица 1), %.

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе менее 0,01 мг/кг" <*>.

--------------------------------

<*> 0,01 мг/кг - предел обнаружения.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6.2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):