"МУК 4.1.2452-09. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств гидразида малеиновой кислоты (малеинового гидразида) в клубнях картофеля и луке-репке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 02.02.2009)

1. Разработаны: Российским государственным аграрным университетом - МСХА им. К.А. Тимирязева, Учебно-научным консультационным центром "Агроэкология пестицидов и агрохимикатов" Минсельхоза России.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 25 декабря 2008 г. N 3).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 2 февраля 2009 г.

4. Введены в действие с 29 апреля 2009 г.

5. Введены впервые.

Настоящие методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации малеинового гидразида в диапазоне 4 - 40 мг/кг в клубнях картофеля и луке-репке.

Гидразид малеиновой кислоты

Название действующего вещества по ИСО: Малеиновый гидразид.

Название действующего вещества по ИЮПАК: 6-гидрокси-2H-пирадизин-3-он.

Структурная формула (не приводится).

Температура плавления: 298 - 300 °C.

Температура кипения: не достижима.

Плотность: 1,61 г/мл.

Растворимость в воде: 4,417 г/л (pH 4,3; 25 °C), 144 г/л (pH 7; 20 °C), 145,8 г/л (pH 9; 20 °C).

Растворимость в органических растворителях: в метаноле 4,179 г/л, в толуоле менее 1 мг/л, в гексане менее 1 мг/л, в ацетоне 188 мг/л, этилацетате 35,9 мг/л, 1,2-дихлорэтане менее 4 мг/л.

Устойчив к гидролизу при pH 3,6 и 9 (45 °C).

Область применения: малеиновый гидразид регулирует рост растений, проникает в растения через листья и корни, переходя в ксилему и флоэму. Эффективен как ингибитор деления клеток в меристематических тканях, но не препятствует росту клеток. Также обладает небольшой гербицидной активностью.

Ингибирует прорастание картофеля, лука, свеклы, брюквы и моркови при хранении. Предлагается для предуборочной обработки плантаций лука-репки и картофеля с нормой расхода 3 - 4 кг д.в./га.

В России для гидразида малеиновой кислоты установлены следующие гигиенические нормативы: МДУ в клубнях картофеля, корнеплодах моркови, свеклы сахарной и столовой, луке-репке, чесноке, томатах, арбузах, табаке - 8,0.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 2.

Метод основан на определении малеинового гидразида методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием ультрафиолетового детектора после его экстракции из образцов органическим растворителем, очистки экстракта на концентрирующих патронах Диапак С16.

Идентификация вещества проводится по времени удерживания, а количественное определение - методом абсолютной калибровки.

В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Специфичность обеспечивается подбором состава подвижной фазы, использованием специфической длины волны спектра поглощения и выбором колонок различной полярности.

Допускается использование средств измерений с аналогичными или лучшими характеристиками.

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичными или лучшими характеристиками.

Допускается применение хроматографических колонок и другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно-допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда по ГОСТ 12.0.004.

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на жидкостном хроматографе.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией "лаборант", имеющего опыт работы в химической лаборатории.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, подготовка концентрирующих патронов Диапак С16 для очистки экстракта, проверка хроматографического поведения вещества на патронах, построение калибровочной кривой.

7.1.1. Очистка ацетонитрила. Ацетонитрил перегоняют.

7.1.2. Очистка метанола. Метанол сушат над безводным поташом и перегоняют.

7.1.3. Очистка бидистиллированной воды. Бидистиллят кипятят в течение 6 часов с марганцовокислым калием, добавленным из расчета 1 г/л и затем перегоняют.

7.2.1. Приготовление подвижной фазы для ВЭЖХ. Для приготовления подвижной фазы используют свежеперегнанные ацетонитрил и очищенную воду, а также муравьиную кислоту.

В плоскодонную колбу объемом 1 куб. дм помещают 990 куб. см очищенной воды и 10 куб. см ацетонитрила, добавляют 4 мл муравьиной кислоты. pH должен быть 2 - 2,2. Смесь тщательно перемешивают, пропускают через нее газообразный гелий со скоростью 20 куб. см/мин. в течение 5 мин., после чего помещают в ультразвуковую ванну для удаления растворенных газов на 1 мин.

7.2.2. Приготовление градуировочных растворов.

7.2.2.1. Стандартный раствор с концентрацией малеинового гидразида 1,0 мг/куб. см. Взвешивают 50 мг малеинового гидразида в мерной колбе объемом 50 куб. см. Навеску растворяют в подвижной фазе и доводят объем до метки.

7.2.2.2. Стандартный раствор с концентрацией малеинового гидразида 400, 200, 100, 80, 50, 40, 20, 10, 5 мкг/куб. см. Методом последовательного разведения подвижной фазой готовят растворы, содержащие по 400, 200, 80, 40 мкг/куб. см и используют эти растворы для внесения в образцы, и растворы концентрацией 100, 50, 20, 10, 5 для хроматографического исследования и построения калибровочной кривой.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади (высоты) пика от концентрации малеинового гидразида в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по пяти растворам для градуировки с концентрацией 100; 50; 20, 10 и 5 мкг/куб. см.

В инжектор хроматографа вводят по 5 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.2. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений.

7.4.1. Подготовка концентрирующего патрона Диапак С16 для очистки экстракта. Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 куб. см/мин.

Патрон Диапак С16 устанавливают на алонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 куб. см (используют как емкость для элюентов).

Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают 10 куб. см подвижной фазы. Элюат отбрасывают.

Нельзя допускать высыхания поверхности патрона.

7.4.2. Проверка хроматографического поведения малеинового гидразида на концентрирующем патроне Диапак С16. Из стандартного раствора малеинового гидразида в подвижной фазе, содержащего 40 мкг/куб. см, отбирают 1 куб. см, помещают в плоскодонную колбу объемом 100 куб. см, прибавляют 5 куб. см подвижной фазы, тщательно перемешивают и вносят на патрон. Элюат собирают в концентратор, выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C, сухой остаток растворяют в 5 куб. см подвижной фазы и хроматографируют. Исходный концентратор обмывают 10 куб. см подвижной фазы и вносят на патрон. Элюат собирают в концентратор объемом 100 куб. см, выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C, сухой остаток растворяют в 5 куб. см ацетонитрила и хроматографируют. Определяют фракции, содержащие малеиновый гидразид и полноту смывания с колонки.

Хроматографическую колонку Waters Spherisorb OSD2 с предколонкой Zorbax Eclipse XDB C8 устанавливают в термостате хроматографа и стабилизируют при температуре 30 °C и скорости потока подвижной фазы 1 куб. см/мин. 3 - 4 ч.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов", N 2051-79 от 21.08.79, а также в соответствии с ГОСТ 7176-85 "Картофель свежий продовольственный, заготовляемый и поставляемый. ТУ" и ГОСТ Р 51783-2001 "Лук репчатый свежий, реализуемый в розничной торговой сети. ТУ". Пробы картофеля и лука хранят в морозильной камере при температуре -18 °C.

9.1.1. Экстракция. Образец измельченных клубней картофеля (или лука-репки) массой 10 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции объемом 250 куб. см, прибавляют 30 куб. см метанола и помещают на 5 мин. в ультразвуковую ванну, а затем на 30 мин. на механический встряхиватель. Экстракт декантируют в коническую колбу объемом 250 куб. см через ватный тампон. Экстракцию повторяют еще два раза, используя по 30 куб. см метанола и помещая на 5 мин. в ультразвуковую ванну, а затем на 30 мин. на механический встряхиватель.

Экстракты объединяют в конической колбе объемом 250 куб. см и объединенный экстракт фильтруют через фильтр "красная лента" в концентратор 250 куб. см. Полученный раствор упаривают на роторном испарителе до водного остатка (2 - 2,5 мл). К водному остатку добавляют 6 мл подвижной фазы и фильтруют через плотный ватный тампон в цилиндр на 10 мл.

9.1.2. Очистка на патроне Диапак С16. Полученный раствор вносят на патрон, подготовленный, как указано в п. 7.4.1. Элюат собирают в чистый концентратор. Исходный концентратор обмывают 10 куб. см подвижной фазы, которую вносят на патрон. Элюат объединяют с первым элюатом в концентраторе объемом 100 куб. см и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C. Сухой остаток растворяют в 10 куб. см подвижной фазы, фильтруют от механических примесей на фильтр-патроне для шприцев Cromafil-PET 20/25 с размером пор 0,20 мкм. 20 мкл пробы вводят в хроматограф.

Хроматограф "Agilent Technologies 1200" или другой с аналогичными характеристиками с диодно-матричным детектором или ультрафиолетовым детектором с изменяемой длиной волны.

Колонка стальная Waters Spheresorb OSD2, 4,6 мм x 25 см, зернением 5 мкм.

Предколонка Zorbax Eclipse XDB C8, 2,1 мм x 30 мм, зернением 3,5 мкм.

Температура колонки: 30 °C.

Подвижная фаза: ацетонитрил-вода в соотношении 1:99, 0,4% HCOOH.

Длина волны 300 нм.

Время удерживания малеинового гидразида 5,4 +/- 0,12 мин.

Чувствительность 100 милли ед. абсорбции (mAU) на шкалу.

Объем вводимой пробы 5 куб. мм.

Линейный диапазон детектирования сохраняется в пределах 200 - 2000 нг.

Для обработки результатов хроматографического анализа используется программное обеспечение химического анализа "Agilent Chemstation".

Альтернативная обработка результатов.

Содержание малеинового гидразида рассчитывают по формуле:

A - концентрация стандартного раствора, мкг/см;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;

m - масса анализируемого образца, г (куб. см);

P - содержание малеинового гидразида в аналитическом стандарте, %.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

где дельта - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе менее 0,01 мг/кг" <*>.

--------------------------------

<*> 0,01 мг/кг - предел обнаружения.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.