"МУК 4.1.2334-08. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств пропиконазола в семенах, масле и зеленой массе рапса методом капиллярной газожидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 15.02.2008)

1. Разработаны ГНУ Всероссийским научно-исследовательским институтом фитопатологии.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия населения (протокол от 6 декабря 2007 г. N 3).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия населения, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 15 февраля 2008 г.

4. Введены в действие с 10 апреля 2008 г.

5. Введены впервые.

Настоящие Методические указания устанавливают метод капиллярной газожидкостной хроматографии для определения массовой концентрации пропиконазола в семенах, масле и зеленой массе рапса в диапазоне 0,05 - 0,5 мг/кг.

Название вещества по ИСО: Пропиконазол.

Название вещества по ИЮПАК: (+/-)-1-[2-(2,4-дихлорфенил)-4-пропил-1,3-диоксолан-2-илметил]-1Н-1,2,4-триазол (смесь 2 стереоизомеров в непостоянном соотношении).

Структурная формула (не приводится).

Фунгицид нетоксичен для птиц, пчел, дождевых червей и водорослей.

Рекомендуемый норматив для пропиконазола в семенах и масле рапса - 0,1 мг/кг.

Область применения препарата

Пропиконазол - системный фунгицид широкого спектра действия с защитным и искореняющим эффектом. Механизм его действия связан с подавлением биосинтеза эргостерина. Эффективен против возбудителей мучнистой росы, ржавчины, септориоза, церкоспореллеза, ринхоспориоза, гельминтоспориозной пятнистости, ризоктониоза, монилиниоза на зерновых злаках, кукурузе, рисе, арахисе и косточковых плодовых. Используется для обработки вегетирующих растений.

Применяется в России в качестве фунгицида системного действия путем двукратной обработки вегетирующих растений зерновых злаков и сахарной свеклы с нормой расхода до 0,125 кг д.в./га.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в таблице 2.

Методика основана на определении вещества с помощью капиллярной газожидкостной хроматографии (ГЖХ) с электронозахватным детектором (ЭЗД). Контроль пропиконазола в матрицах осуществляется по содержанию вещества после экстракции его из зеленой массы водным ацетоном, из семян и масла ацетонитрилом, очистки экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей, а также на колонке с оксидом алюминия и концентрирующем патроне Диапак-диол.

Идентификация проводится по времени удерживания, а количественное определение - методом абсолютной калибровки.

В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Избирательность обеспечивается путем подбора капиллярной колонки и условий программирования температуры.

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичной или более высокой квалификацией.

Допускается применение другого оборудования с аналогичными или лучшими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя с опытом работы на газовом хроматографе.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией "лаборант", имеющего опыт работы в химической лаборатории.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 + 5) °С и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики, подготовка колонки с оксидом алюминия и концентрирующего патрона Диапак-диол.

7.1.1. Очистка н-гексана

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до прекращения окрашивания последней в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над поташом.

7.1.2. Очистка ацетона

Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 8 - 10 мм уплотняют тампоном из стекловаты, медленно выливают в колонку (при открытом кране) суспензию 7 г оксида алюминия нейтрального II степени активности в 15 куб. см гексана. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку последовательно промывают 20 куб. см смеси гексан - ацетон (9:1, по объему) и 15 куб. см гексана со скоростью 1 - 2 капли в сек., после чего она готова к работе.

Концентрирующий патрон Диапак-диол промывают последовательно с помощью медицинского шприца 10 куб. см смеси гексан - ацетон (1:1, по объему) и 5 куб. см гексана со скоростью 5 куб. см/мин.

В круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 0,1 куб. см градуировочного раствора N 1 пропиконазола с концентрацией 10 мкг/куб. см в гексане (п. 7.5.2). Отдувают растворитель током теплого воздуха, остаток растворяют в 3 куб. см гексана, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на колонку с оксидом алюминия, подготовленную по п. 7.2. Промывают колонку 50 куб. см гексана со скоростью 1 - 2 капли в сек., элюат отбрасывают. Затем колонку промывают 60 куб. см смеси гексан - ацетон (9:1, по объему). Фракционно (по 10 куб. см) отбирают элюат, упаривают, остатки растворяют в 1 куб. см гексана, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., и анализируют на содержание пропиконазола по п. 9.5.

Капиллярную кварцевую колонку ZB-1 (типа SE-30) устанавливают в термостат хроматографа и, не подсоединяя к детектору, кондиционируют при температуре 280 °С и скорости газа-носителя 2 куб. см/мин. в течение 8 - 10 часов.

7.5.1. Исходный раствор пропиконазола для градуировки (концентрация 100 мкг/куб. см). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 0,010 г пропиконазола, растворяют в 40 - 50 куб. см гексана, доводят этим же растворителем до метки, тщательно перемешивают.

Раствор хранят в морозильной камере при температуре не выше -18 °С в течение 3-х месяцев.

7.5.2. Раствор пропиконазола N 1 для градуировки (концентрация 10 мкг/куб. см).

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 10 куб. см исходного раствора пропиконазола с концентрацией 100 мкг/куб. см (п. 7.5.1), разбавляют гексаном до метки. Этот раствор используют для приготовления рабочих градуировочных растворов N 2 - 5.

Для приготовления проб семян и зеленой массы с внесением при оценке полноты извлечения пропиконазола из исследуемых образцов используют ацетоновый раствор пропиконазола с концентрацией 10 мкг/куб. см, а для приготовления проб масла - раствор пропиконазола в гексане с концентрацией 10 мкг/куб. см.

Градуировочный раствор N 1, а также ацетоновый и гексановый растворы пропиконазола хранят в морозильной камере при температуре не выше -18 °С в течение месяца.

7.5.3. Рабочие растворы N 2 - 5 пропиконазола для градуировки (концентрация 0,05 - 0,5 мкг/куб. см).

В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают 0,5; 1,0; 2,5 и 5,0 куб. см градуировочного раствора N 1 пропиконазола с концентрацией 10 мкг/куб. см (п. 7.5.2), доводят до метки гексаном, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 2 - 5 с концентрацией пропиконазола 0,05; 0,1; 0,25 и 0,5 мкг/куб. см соответственно.

Растворы готовят непосредственно перед использованием.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (мВ х с) от концентрации пропиконазола в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки. На график наносят сумму площадей двух характерных пиков.

В инжектор хроматографа вводят по 1 куб. мм каждого градуировочного раствора (п. 7.5.3) и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.5. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79) и правилами, определенными ГОСТом 10852-86 "Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб" и ГОСТом 8988-77 "Масло рапсовое. ТУ".

Пробы зеленой массы хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике не более одного дня; для длительного хранения пробы замораживают и хранят при температуре -18 °С до анализа. Пробы семян высушивают до стандартной влажности и хранят в бумажных или тканевых мешочках в сухом, хорошо проветриваемом шкафу. Пробы масла хранят в плотно закрытой стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике при температуре не выше 4 °С. В некоторых случаях масло получают из семян рапса экстракцией органическими неполярными растворителями (петролейный и диэтиловый эфиры) непосредственно перед проведением анализа.

9.1.1. Зеленая масса. Образец измельченного растительного материала массой 20 г помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 куб. см, добавляют 100 куб. см смеси ацетон - вода (8:2, по объему) и суспензию перемешивают в течение 1 часа на аппарате для встряхивания. Суспензию фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу вместимостью 250 куб. см. Осадок на фильтре промывают 50 куб. см смеси ацетон - вода (8:2, по объему). Экстракт и промывную жидкость переносят в химический стакан, перемешивают, измеряют объем раствора и 1/10 его часть (эквивалентную 2 г образца) переносят в круглодонную колбу, куда добавляют 10 куб. см деионизованной воды. Далее проводят очистку экстракта по п. 9.2.

9.1.2. Семена. Образец размолотых семян массой 10 г помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 куб. см, добавляют 70 куб. см ацетонитрила и помещают на аппарат для встряхивания на 1 час. Суспензию фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу вместимостью 250 куб. см. Осадок на фильтре промывают 30 куб. см ацетонитрила. Экстракт и промывную жидкость переносят в химический стакан, перемешивают, измеряют объем раствора и 1/5 его часть (эквивалентную 2 г образца) переносят в круглодонную колбу, куда добавляют 20 куб. см деионизованной воды. Дальнейшую очистку экстракта проводят по п. 9.2.

9.1.3. Масло. К образцу масла массой 5 г, помещенного в плоскодонную колбу вместимостью 250 куб. см, добавляют 50 куб. см ацетонитрила и колбу помещают на встряхиватель на 30 мин. Верхний ацетонитрильный слой декантируют в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см через слой ваты, помещенный в конусную воронку. К оставшемуся в колбе маслу приливают 20 куб. см ацетонитрила и операцию экстракции повторяют. После декантации ацетонитрильного слоя вату промывают 10 куб. см ацетонитрила, которые объединяют с фильтратом. Объединенную ацетонитрильную фазу, пропущенную через вату, переносят в химический стакан, перемешивают, измеряют объем раствора и 2/5 его части (эквивалентные 2 г образца) переносят в плоскодонную колбу вместимостью 100 куб. см. Раствор помещают в морозильник холодильника на 3 часа и затем фильтруют через бумажный фильтр в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. К фильтрату добавляют 20 куб. см деионизованной воды. Дальнейшую очистку экстракта проводят по п. 9.2.

Экстракты, полученные по п. п. 9.1.1, 9.1.2 и 9.1.3 и помещенные в круглодонные колбы, упаривают на ротационном вакуумном испарителе до водного остатка (8 - 10 куб. см) при температуре не выше 40 °С. К водному остатку прибавляют 15 куб. см насыщенного раствора хлорида натрия, перемешивают и переносят в делительную воронку вместимостью 100 куб. см. В воронку вносят 20 куб. см гексана, интенсивно встряхивают в течение 2-х мин. После разделения фаз верхний органический слой фильтруют через слой безводного сульфата натрия в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. Операцию экстракции водной фазы повторяют еще дважды, используя по 20 куб. см гексана. Объединенную органическую фазу, пропущенную через слой сульфата натрия, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре 30 °С и подвергают дополнительной очистке на колонке по п. 9.3.

Сухой остаток в круглодонной колбе, полученный по п. 9.2, растворяют в 3 куб. см гексана, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на колонку, подготовленную по п. 7.2. Колбу обмывают 3 куб. см гексана, которые также наносят на колонку. Промывают колонку 45 куб. см гексана со скоростью 1 - 2 капли в сек., элюат отбрасывают. Пропиконазол элюируют с колонки 50 куб. см смеси гексан - ацетон (9:1, по объему), собирая элюат непосредственно в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. Раствор упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре 30 °С.

Сухой остаток в круглодонной колбе, полученный по разделу 9.3, растворяют при помощи ультразвуковой ванны в 2 куб. см гексана и переносят в подготовленный концентрирующий патрон Диапак-диол (п. 7.2). Патрон промывают 5 куб. см смеси гексан - ацетон (9:1, по объему), элюат отбрасывают. Пропиконазол элюируют 5 куб. см смеси гексан - ацетон (8:2, по объему) в круглодонную колбу вместимостью 25 куб. см. Раствор упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 30 °С. Остаток в колбе растворяют в 5 куб. см гексана, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., и раствор анализируют на содержание пропиконазола по п. 9.5.

Колонка капиллярная кварцевая ZB-1, длина 25 м, внутренний диаметр 0,32 мм, толщина пленки 0,5 мкм, неподвижная фаза SE-30, фирма Phenomenex (США).

Температура термостата испарителя - 260 °С, детектора - 300 °С, термостата колонки (программа: от 220 °С (2 мин.) со скоростью 2°/мин. до 230 °С (6 мин.); со скоростью 10°/мин. до 260 °С (5 мин.)).

Расход газов: газа-носителя (азот) - 2,8 куб. см/мин.; поддувочного газа через детектор - 4,2 куб. см/мин.

Деление потока: 1:1,5.

Время удерживания характерных пиков пропиконазола:

Пропиконазола 1 - 7 мин. 30 сек.

Пропиконазола 2 - 7 мин. 45 сек.

Объем вводимой пробы: 1 куб. мм.

Линейный диапазон детектирования: 0,02 - 0,5 нг.

Каждую анализируемую пробу вводят 3 раза и вычисляют среднюю сумму площадей характерных пиков пропиконазола.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор с концентрацией 0,2 мкг/куб. см, разбавляют гексаном.

Для обработки результатов хроматографического анализа используется программа сбора и обработки хроматографической информации "Хроматэк Аналитик", версия 1.20.

Альтернативная обработка результатов.

Содержание пропиконазола рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе "менее нижней границы определения" < 0,05 мг/кг для рапса (семена, масло и зеленая масса) <*>.

--------------------------------

<*> 0,05 мг/кг - предел обнаружения для рапса.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):