"МУК 4.1.2395-08. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методические указания по определению остаточных количеств флуопиколида в воде, почве и клубнях картофеля методом капиллярной газожидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 02.07.2008)

1. Разработаны Российским государственным аграрным университетом - МСХА им. К.А. Тимирязева, Учебно-научный консультационный центр "Агроэкология пестицидов и агрохимикатов".

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 3 апреля 2008 г. N 1).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 2 июля 2008 г.

4. Введены в действие с 5 сентября 2008 г.

5. Введены впервые.

Настоящие Методические указания устанавливают метод газожидкостной хроматографии для определения массовой концентрации Флуопиколида в воде в диапазоне 0,005 - 0,05 мг/л и в почве в диапазоне 0,02 - 0,2 мг/кг; а также уровня остаточных количеств в клубнях картофеля в диапазоне 0,01 - 0,1 мг/кг.

Название действующего вещества по ИСО: Флуопиколид.

Название по ИЮПАК: 2,6-дихлоро-N-[3-хлоро-5-(трифторметил)-2-пиредилметил]бензамид.

Структурная формула (не приводится).

Молекулярная масса: 383,59.

Агрегатное состояние: порошок.

Цвет, запах: бежевый, фенольный.

Давление насыщенного пара: 8,03 мПа при 25 °С.

В России установлены следующие гигиенические нормативы:

ПДК в воде - 0,05 мг/куб. дм; ОДК в почве - 0,14 мг/кг;

ВМДУ в клубнях картофеля - 0,05 мг/кг.

Флуопиколид - контактно-системный фунгицид, проявляющий активность против грибов класса Оомицеты. Нарушает прорастание зооспор и конидий, ингибирует спорообразование и развитие мицелия.

Высоко эффективен в подавлении фитофтороза на картофеле и томатах при норме расхода 80 - 120 г д.в. на га в период вегетации культуры до четырех обработок за сезон с интервалом между обработками 7 - 10 дней в зависимости от погодных условий и развития болезни. Используется для производства заводских смесей фунгицидов.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в таблице 2.

Метод основан на определении Флуопиколида методом капиллярной ГЖХ с использованием детектора по захвату электронов после экстракции его из матрицы органическим растворителем, перераспределения между двумя несмешивающимися растворителями и последующей очистки на колонках с Флоризилом.

Идентификация проводится по времени удерживания. Количественное определение - методом абсолютной калибровки.

В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Избирательность обеспечивается путем подбора капиллярной колонки и условий программирования температуры.

Весы аналитические "OHAUS", СИГМА 11140.

Весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания до 600 г и пределом допустимой погрешности +/- 0,038 г "ACCULAB" V600.

Колбы мерные на 25, 50, 100 куб. см, ГОСТ 1770-74.

Микрошприц на 10 куб. мм, ТУ 2.833.106.

Пипетки мерные на 1,0; 2,0; 5,0 куб. см, ГОСТ 20292-74.

Цилиндры мерные на 10, 25 и 50 куб. см, ГОСТ 1770-74.

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Аналитический стандарт Флуопиколид с содержанием 98,9% д.в. (фирма Байер КропСайенс АГ).

Азот особой чистоты, ГОСТ 9293-74.

Ацетон, х.ч., ТУ 6-09-3513-86.

Ацетонитрил, ТУ 6-09-3534-87.

Вода дистиллированная, ГОСТ 7602-72.

н-Гексан, ч., ТУ 6-09-3375-78.

Гелий очищенный марки "А", ТУ 51-940-80.

Натрий сернокислый, безводный, х.ч., ГОСТ 4166-76.

Натрия хлорид, х.ч., ГОСТ 4233-77.

Флоризил для колоночной хроматографии с размером частиц 60 - 80 меш, фирма "Агрос Органикс", Бельгия, код 205450010.

Стандартный раствор Флуопиколида в ацетоне - 1 мг/куб. см (хранить в холодильнике, срок годности 120 суток).

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичной или более высокой классификации.

Аппарат для встряхивания проб "SKLO UNION TYP LT1".

Банки с крышками для экстракции на 250 куб. см, полипропилен, кат. N 3120-0250, NALGENE.

Ванна ультразвуковая "UNITRA" UNIMA OLSZTYN UM-4.

Виалы с тефлоновыми прокладками, Aldrich, cat. N Z27,702-9.

Воронки химические для фильтрования стеклянные, ГОСТ 8613-75.

Воронки делительные на 250 куб. см, ГОСТ 10054-75.

Испаритель ротационный Rotavapor R110 Buchi с водяной баней В-480, фирма Буши.

Колбы конические плоскодонные на 100 и 250 куб. см, КПШ-100, КПШ-250, ГОСТ 10394-72.

Концентраторы грушевидные (конические) 250 куб. см, ГОСТ 10394-72.

Колонка хроматографическая капиллярная кварцевая НР-1 (100% метилсилоксана), длина 30 м, внутренний диаметр 0,25 мм, толщина пленки 0,25 мкм, фирмы Хьюлетт Паккард.

Насос диафрагменный FT.19 фирмы KNF Neu Laboport.

Фильтры бумажные "Красная лента", ТУ 6-09-1678-86.

Центрифуга MPW-350е с набором полипропиленовых банок емкостью 200 куб. см.

Допускается применение хроматографических колонок и другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на газовом хроматографе.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией "лаборант", имеющего опыт работы в химической лаборатории.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °С и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

На дно пластиковой хроматографической колонки (высота 15 см, диаметр 1,5 см) помещают пробочку из стекловаты и заполняют колонку Флоризилом на высоту 10 см. На слой Флоризила насыпают слой безводного сернокислого натрия толщиной 1,0 см. Перед нанесением пробы колонку промывают 10 куб. см ацетона, высушивают и 10 куб. см гексана. Колонка готова к работе.

При отработке методики или поступлении новой партии Флоризила проводят изучение поведения Флуопиколида на колонке. В концентратор вносят 1 куб. см стандартного раствора Флуопиколида в ацетоне с концентрацией 0,1 мкг/куб. см и выпаривают его досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре водяной бани не выше 25 - 30 °С. Добавляют 5 куб. см смеси гексана с ацетоном в соотношении 9:1, растворяют содержимое концентратора и наносят на колонку, подготовленную, как описано в пункте 7.1. В концентратор добавляют 10 куб. см смеси гексана с ацетоном в соотношении 9:1, ополаскивают стенки и наносят на колонку. Затем наносят на колонку 5 куб. см смеси гексана с ацетоном в соотношении 4:1, элюат отбрасывают. Флуопиколид элюируют с колонки последовательно 4-мя порциями объемом 5 куб. см каждая смеси гексана с ацетоном в соотношении 7:3. Каждую порцию собирают отдельно в концентраторы и выпаривают досуха при температуре водяной бани не выше 25 - 30 °С.

Сухой остаток каждой фракции растворяют в 1 куб. см ацетона и 1 куб. мм пробы вводят в хроматограф.

Рассчитывают содержание вещества в элюате, определяют полноту смывания с колонки и необходимый объем элюата.

7.3.1. Приготовление стандартных растворов

100 мг Флуопиколида (аналитического стандарта) вносят в мерную колбу вместимостью 100 куб. см, растворяют навеску в ацетоне и доводят объем до метки ацетоном (стандартный раствор N 1, концентрация 1 мг/куб. см). Раствор хранится в холодильнике около 120 суток.

Методом последовательного разбавления исходного раствора N 1 ацетоном готовят стандартный раствор N 2 с концентрацией 10,0 мкг/куб. см, который может храниться в холодильнике не более 30 суток.

Методом последовательного разбавления исходного раствора N 2 ацетоном готовят рабочие растворы Флуопиколида с концентрацией 0,01; 0,02; 0,05; 0,1; 0,2; 0,5 мкг/куб. см для построения калибровочного графика и для внесения в образцы, которые могут храниться в холодильнике не более 10 суток.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади (высоты) пика от концентрации Флуопиколида в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 6-ти растворам для градуировки с концентрацией 0,01; 0,02; 0,05; 0,1; 0,2; 0,5 мкг/куб. см.

В испаритель хроматографа вводят по 1 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.4. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений.

По полученным данным строят градуировочный график зависимости площади хроматографического пика в мВ от концентрации Флуопиколида в растворе в мкг/куб. см (рисунок 1 - не приводится).

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" N 2051-79 от 21.08.79, а также в соответствии с ГОСТ Р 51592-2000 "Вода. Общие требования к отбору проб", ГОСТ 1743.01-83 "Почвы. Общие требования к отбору проб", ГОСТ 26950-89 "Почвы. Отбор проб", ГОСТ 7176-85 "Картофель свежий продовольственный, заготовляемый и поставляемый. ТУ", ГОСТ 26832-86 "Картофель свежий для переработки на продукты питания. ТУ".

Пробы воды хранят в герметично закрытой стеклянной таре в холодильнике при температуре 0 - 4 °С.

Пробы почвы просушивают в затененном месте, хранят в сухом шкафу при комнатной температуре.

Пробы клубней картофеля хранят в холодильнике в полиэтиленовых пакетах при температуре 0 - 4 °С в течение до 3-х суток. Для длительного хранения пробы замораживают и хранят в морозильной камере при температуре -18 °С до 2-х лет.

Перед анализом почву растирают, просеивают через сито с ячейками диаметром 0,1 мм. Клубни картофеля размораживают и измельчают на терке.

Пробу воды объемом 100 куб. см переносят в делительную воронку объемом 250 куб. см. Добавляют 5 г хлорида натрия, растворяют. Добавляют 30 куб. см гексана и встряхивают делительную воронку в течение двух минут. После полного разделения слоев нижний водный слой собирают в плоскодонную колбу, а верхний гексановый слой переносят в концентратор, пропуская через слой безводного сульфата натрия. Водную фазу возвращают в делительную воронку и повторяют экстракцию еще два раза, используя каждый раз по 30 куб. см гексана. Объединенную гексановую фракцию выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 30 °С.

Сухой остаток растворяют в 10 куб. см ацетона и 1 куб. мм вводят в хроматограф.

9.2.1. Экстракция

Навеску 10 г почвы помещают в центрифужную полипропиленовую банку и смачивают ее 10 куб. см дистиллированной воды. К навеске прибавляют 50 куб. см ацетонитрила и помещают в ультразвуковую ванну на 10 минут. Далее встряхивают смесь на встряхивателе в течение 10 минут. Затем пробу центрифугируют 10 минут при 4000 об./мин. и фильтруют полученный экстракт методом декантации через фильтр "красная лента" в концентратор. Повторяют экстракцию еще два раза, используя по 50 куб. см ацетонитрила. Экстракты объединяют в концентраторе.

Из объединенного экстракта отбирают аликвоту 75 куб. см (1/2 часть) и выпаривают ацетонитрил на ротационном вакуумном испарителе при температуре водяной бани не выше 30 °С досуха.

9.2.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей

К сухому остатку в концентратор добавляют 5 куб. см ацетона, тщательно обмывают стенки концентратора, туда же приливают 50 куб. см дистиллированной воды, перемешивают и переносят водную фазу в делительную воронку на 250 куб. см. В концентратор добавляют еще раз 50 куб. см дистиллированной воды, тщательно обмывают стенки и переносят водную фазу в ту же делительную воронку. Добавляют 5 г хлорида натрия и встряхивают воронку до полного растворения осадка.

Добавляют к водной фазе 30 куб. см гексана и интенсивно встряхивают смесь в течение 1 - 2 мин. После разделения слоев нижний водный слой собирают в тот же концентратор, а верхний (гексановый) собирают в чистый концентратор, пропуская через слой безводного сульфата натрия. Водную фракцию возвращают в делительную воронку и экстрагируют Флуопиколид еще дважды, используя для этого каждый раз 30 куб. см гексана. Объединенный гексановый экстракт выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 25 - 30 °С.

9.2.3. Очистка экстракта на колонке с Флоризилом

Сухой остаток в концентраторе, полученный по пункту 9.2.2, растворяют в 5 куб. см смеси гексана с ацетоном в соотношении 9:1, обмывают стенки концентратора и полученный раствор наносят на подготовленную колонку согласно пункту 7.1. В концентратор добавляют 10 куб. см смеси гексана с ацетоном в соотношении 9:1, ополаскивают стенки и наносят на колонку. Затем наносят на колонку 5 куб. см смеси гексана с ацетоном в соотношении 4:1, элюат отбрасывают. Флуопиколид элюируют с колонки 10 куб. см смеси гексана с ацетоном в соотношении 7:3 и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре водяной бани не выше 25 - 30 °С.

Сухой остаток растворяют в 10 куб. см ацетона и 1 куб. мм пробы вводят в хроматограф.

9.3.1. Экстракция

Навеску 10 г клубней картофеля помещают в полипропиленовую банку. К навеске прибавляют 50 куб. см ацетонитрила и помещают в ультразвуковую ванну на 10 минут. Далее встряхивают смесь на встряхивателе в течение 10 минут и фильтруют полученный экстракт методом декантации через фильтр "красная лента" в концентратор. Повторяют экстракцию еще два раза, используя по 50 куб. см ацетонитрила. Экстракты объединяют в концентраторе и выпаривают ацетонитрил на ротационном вакуумном испарителе при температуре водяной бани не выше 30 °С досуха.

Далее проводят анализ, как указано в пунктах 9.2.2 и 9.2.3.

Колонка хроматографическая капиллярная кварцевая НР-5 (5% фенила - 95% метилсилоксана), длина 30 м, внутренний диаметр 0,25 мм, толщина пленки 0,25 мкм.

Температура детектора - 320 °С, испарителя - 250 °С, программированный нагрев колонки со 160 °С (выдержка 1 минута) по 10 град./мин. до 220 °С, с 220 °С по 15 град./мин. до 250 °С.

Газ 1: тип регулятора расхода газа РРГ 11, режим нормальный, скорость 20 см/с, давление 89,45 кПа.

Газ 2 (гелий) - сброс 1:10, расход 0,5 куб. см/мин.

Газ 3 (азот, поддув детектора) - 45 куб. см/мин.

Продувка: температура колонки 270 °С, газ 2 - 60 куб. см/мин., газ 3 - 60 куб. см/мин., время 5 минут.

Абсолютное время удерживания Пропаргита - 12 мин. 53 сек. +/- 2%.

Линейность детектирования сохраняется в пределах - 0,5 - 5,0 нг.

Каждую анализируемую пробу вводят в хроматограф 3 раза и вычисляют среднюю площадь пика.

Образцы, дающие пики больше, чем стандартный раствор с концентрацией Пропаргита 5,0 мкг/куб. см, соответственно разбавляют.

Количественное определение Пропаргита проводят по методу абсолютной калибровки посредством сравнения с хроматограммами стандартных растворов Пропаргита с концентрацией 0,5 - 5,0 мкг/куб. см.

Для обработки результатов хроматографического анализа используется программа сбора и обработки хроматографической информации "Хроматэк Аналитик", версия 1.20.

Альтернативная обработка результатов.

Содержание Пропаргита рассчитывают по формуле:

где:

Х - содержание Пропаргита в пробе, мг/кг;

Sст - высота (площадь) пика стандарта, мВ;

Sпр - высота (площадь) пика образца, мВ;

А - концентрация стандартного раствора, мкг/куб. см;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;

m - масса анализируемого образца, г;

Р - содержание Флуопиколида в аналитическом стандарте, %.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе менее 0,01 мг/кг" <*>.

-------------------------------

<*> 0,01 мг/кг - предел обнаружения.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6.2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):