"МУК 4.1.2272-07. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств феноксикарба в яблоках, сливах и винограде методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 24.09.2007)

1. Разработаны Всероссийским научно-исследовательским институтом фитопатологии.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол N 2 от 21.06.2007).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 24 сентября 2007 г.

4. Введены в действие с 10 декабря 2007 г.

5. Введены впервые.

Настоящие Методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации феноксикарба в яблоках и сливах в диапазоне 0,01 - 0,1 мг/кг, в ягодах в соке винограда в диапазоне 0,05 - 0,5 мг/кг.

Название вещества по ИСО: Феноксикарб.

Название вещества по ИЮПАК: Этил [2-(4-феноксифе-нокси)этил]карбамат.

Структурная формула (не приводится).

Инсектицид не токсичен для птиц, дафний, земляных червей, почвенных микроорганизмов и пчел.

Гигиенические нормативы для феноксикарба в России:

ДСД - 0,05 мг/кг/сутки;

МДУ в яблоках и сливах - 0,01 мг/кг, в винограде - 0,1 мг/кг.

Область применения

Феноксикарб - регулятор роста насекомых ювеноидного типа с контактно-кишечным действием. Применяется против вредителей из отряда чешуекрылых на хлопчатнике, виноградниках, фруктовых деревьях и декоративных культурах.

Применяется в России в качестве инсектицида для борьбы с яблонной и сливовой плодожоркой, гроздевой листоверткой на плодовых семечковых и косточковых культурах и виноградниках путем одно-, трехкратного опрыскивания в течение вегетационного сезона с нормой расхода 0,1 - 0,15 кг д.в./га.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в таблице 2.

Методика основана на определении феноксикарба с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовым детектором. Контроль феноксикарба в образцах яблок, сливы, ягод и сока винограда осуществляется по содержанию вещества после экстракции его из сока гексаном, из яблок, слив и ягод метанолом, очистки экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей, а также на колонке с силикагелем и концентрирующем патроне Диапак С8.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичной или более высокой квалификацией.

Допускается применение другого оборудования с аналогичными или лучшими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими веществами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостной хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя с опытом работы на жидкостном хроматографе.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией "лаборант", имеющего опыт работы в химической лаборатории.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 + 5)°С и относительной влажности не более 80%.

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление растворов, подвижной фазы для ВЭЖХ, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики, подготовка колонки с силикагелем и концентрирующего патрона Диапак С8.

7.1.1. Очистка ацетонитрила

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора не менее 1 часа, после чего перегоняют. Непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия.

7.1.2. Очистка н-гексана

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до прекращения окрашивания ее в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над поташом.

7.1.3. Очистка этилацетата

Этилацетат промывают последовательно 5%-ным водным раствором карбоната натрия, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над безводным карбонатом калия и перегоняют.

7.1.4. Очистка силикагеля

Силикагель 60 (0,063 - 0,20 мм) для колоночной хроматографии встряхивают с двойным объемом очищенного ацетона и затем фильтруют на воронке Бюхнера через бумажный фильтр. Силикагель на фильтре промывают 1,5 объема ацетона и затем высушивают при температуре 130 °С в течение 5 часов.

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают соответственно 0,34 куб. см или 0,68 куб. см 85%-ной ортофосфорной кислоты, доводят водой до метки, перемешивают.

Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 8 - 10 мм уплотняют тампоном из стекловаты, медленно выливают в колонку (при открытом кране) суспензию 5 г силикагеля I степени активности в 20 куб. см гексана. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку последовательно промывают 20 куб. см смеси гексан - этилацетат (1:9, по объему) и 30 куб. см смеси гексан - этилацетат (8:2, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в сек., после чего она готова к работе.

Концентрирующий патрон Диапак С8 промывают последовательно с помощью медицинского шприца 7 куб. см ацетонитрила и 7 куб. см смеси ацетонитрил - вода (4:6, по объему) со скоростью 5 куб. см/мин.

В круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 0,1 куб. см градуировочного раствора N 1 феноксикарба с концентрацией 10 мкг/куб. см в ацетонитриле (п. 7.7.2), раствор упаривают досуха, остаток растворяют в 3 куб. см смеси гексан - этилацетат (8:2, по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на колонку, подготовленную по п. 7.3. Промывают колонку 30 куб. см смеси гексан - этилацетат (8:2, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в сек., элюат отбрасывают. Затем колонку промывают 50 куб. см смеси гексан - этилацетат (7:3, по объему). Фракционно (по 10 куб. см) отбирают элюат, упаривают, остатки растворяют в 1 куб. см ацетонитрила, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., вносят 2 куб. см подвижной фазы, подготовленной по п. 7.5, перемешивают и анализируют на содержание феноксикарба по п. 9.5.

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 650 куб. см ацетонитрила, 350 куб. см 0,005 М водного раствора ортофосфорной кислоты (п. 7.2), перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр. Эта подвижная фаза 1 используется при исследовании образцов винограда и сливы.

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 500 куб. см ацетонитрила, 500 куб. см 0,01 М водного раствора ортофосфорной кислоты (п. 7.2), перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр. Эта подвижная фаза 2 используется при исследовании образцов яблок.

Промывают колонку подвижной фазой (приготовленной по п. 7.5) при скорости подачи растворителя 1 куб. см/мин. не менее часа до установления стабильной базовой линии.

7.7.1. Исходный раствор феноксикарба для градуировки (концентрация 100 мкг/куб. см). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 0,010 г феноксикарба, растворяют в 40 - 50 куб. см ацетонитрила, доводят ацетонитрилом до метки, тщательно перемешивают.

Раствор хранят в морозильной камере при температуре не выше -18 °С в течение 3-х месяцев.

7.7.2. Раствор феноксикарба N 1 для градуировки (концентрация 10 мкг/куб. см).

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 10 куб. см исходного раствора феноксикарба с концентрацией 100 мкг/куб. см (п. 7.7.1), разбавляют ацетонитрилом до метки. Этот раствор используют для приготовления рабочих градуировочных растворов N 2 - 5.

Для приготовления проб яблок, слив, ягод и сока винограда с внесением при оценке полноты извлечения феноксикарба из исследуемых образцов используют ацетонитрильный раствор феноксикарба с концентрацией 1 мкг/куб. см.

Градуировочный раствор N 1 хранят в морозильной камере при температуре не выше -18 °С в течение месяца.

7.7.3. Рабочие растворы N 2 - 5 феноксикарба для градуировки (концентрация 0,05 - 0,5 мкг/куб. см).

В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают 0,5; 1,0; 2,5 и 5,0 куб. см градуировочного раствора N 1 феноксикарба с концентрацией 10 мкг/куб. см (п. 7.7.2), доводят до метки подвижной фазой, приготовленной по п. 7.5, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 2 - 5 с концентрацией феноксикарба 0,05; 0,10; 0,25 и 0,5 мкг/куб. см соответственно.

Растворы готовят непосредственно перед использованием.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость высоты пика (мм) от концентрации феноксикарба в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4-м растворам для градуировки.

В инжектор хроматографа вводят по 20 куб. мм каждого градуировочного раствора (п. 7.7.3) и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.5. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79) и правилами, определенными ГОСТом 25896-83 "Виноград свежий столовый", ГОСТом 16270-70 "Яблоки свежие ранних сортов созревания. ТУ", ГОСТом 21122-75 "Яблоки свежие поздних сортов созревания. ТУ", ГОСТом 27572-87 "Яблоки свежие для промышленной переработки. ТУ", ГОСТом 21920-76 "Слива и алыча крупноплодная. ТУ".

Пробы плодов и ягод хранят в стеклянной посуде в холодильнике при температуре 4 °С не более 2-х дней; при длительном хранении пробы замораживают и хранят в морозильной камере при температуре -18 °С. Сок получают из ягод непосредственно перед проведением анализа. Перед анализом плоды и ягоды измельчают.

9.1.1. Плоды, ягоды. Навеску (20 г) измельченного растительного материала помещают в стакан гомогенизатора вместимостью 500 куб. см, приливают 100 куб. см метанола и гомогенизируют 5 минут при 8000 об./мин. Гомогенат фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу вместимостью 250 куб. см. Осадок на фильтре промывают 50 куб. см метанола. Экстракт и промывную жидкость переносят в химический стакан, перемешивают, измеряют объем раствора и 1/4 его часть (эквивалентна 5 г образца) переносят в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. Дальнейшую очистку экстракта проводят по п. 9.2.

9.1.2. Сок. Навеску (20 г) свежевыжатого сока помещают в химический стакан вместимостью 100 куб. см, приливают 60 куб. см деионизованной воды и перемешивают. Отбирают 1/4 объема раствора (эквивалентна 5 г образца), переносят в делительную воронку вместимостью 100 куб. см, приливают 25 куб. см насыщенного раствора хлорида натрия и 30 куб. см гексана, интенсивно встряхивают в течение 2-х минут. После разделения фаз верхний органический слой фильтруют через слой безводного сульфата натрия в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. Операцию экстракции водной фазы повторяют еще дважды, используя по 25 куб. см гексана. Объединенную органическую фракцию, пропущенную через слой безводного сульфата натрия, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре 30 °С. Дальнейшую очистку экстракта проводят по п. п. 9.3 и 9.4.

Отобранные аликвоты экстрактов плодов и ягод (из п. 9.1.1) упаривают на ротационном вакуумном испарителе до водного остатка (1 - 2 куб. см) при температуре 40 °С. К водному остатку приливают 15 куб. см деионизованной воды, 25 куб. см насыщенного раствора хлорида натрия, перемешивают и переносят в делительную воронку вместимостью 100 куб. см. В воронку вносят 30 куб. см гексана, интенсивно встряхивают в течение 2-х минут. После разделения фаз верхний органический слой собирают в делительную воронку вместимостью 250 куб. см, а нижнюю водную фазу экстрагируют еще дважды, используя по 25 куб. см гексана. Гексановые фракции объединяют, в воронку вносят 40 куб. см 0,5%-ного водного раствора двууглекислого натрия и содержимое интенсивно встряхивают в течение 2-х минут. После разделения фаз нижний водный слой отбрасывают, а гексановую фракцию повторно обрабатывают 30 куб. см 0,5%-ного водного раствора двууглекислого натрия при встряхивании. После разделения фаз гексановую фракцию фильтруют через слой безводного сульфата натрия в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см и затем упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре 30 °С. Дальнейшую очистку экстракта проводят по п. п. 9.3 и 9.4.

Сухие остатки в круглодонной колбе, полученные по п. п. 9.1.2 и 9.2, растворяют в 2,4 куб. см гексана, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., добавляют 0,6 куб. см этилацетата, перемешивают, вновь помещают в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на колонку, подготовленную по п. 7.3. Колбу обмывают 5 куб. см смеси гексан - этилацетат (8:2, по объему), которые также наносят на колонку. Колонку промывают 15 куб. см смеси гексан - этилацетат (8:2, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в сек., элюат отбрасывают. Феноксикарб элюируют с колонки 45 куб. см смеси гексан - этилацетат (7:3, по объему), отбрасывая первые 10 куб. см элюата и собирая последующие 35 куб. см элюата непосредственно в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. Раствор упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре 30 °С.

Сухой остаток в круглодонной колбе, полученный по п. 9.3, растворяют в 1,2 куб. см ацетонитрила, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., добавляют 1,8 куб. см деионизованной воды, перемешивают, вновь помещают в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на концентрирующий патрон Диапак С8, подготовленный по п. 7.3, элюат отбрасывают. Колонку промывают 2 куб. см смеси ацетонитрил - вода (1:1, по объему), элюат отбрасывают. Феноксикарб элюируют с патрона 5 куб. см смеси ацетонитрил - вода (6:4, по объему), собирая элюат непосредственно в круглодонную колбу. Раствор упаривают досуха при температуре не выше 40 °С. Остаток в колбе растворяют в 1 куб. см (для яблок и слив) или 5 куб. см (для винограда) соответствующей подвижной фазы, подготовленной по п. 7.3, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., и анализируют на содержание феноксикарба по п. п. 9.5.1 или 9.5.2.

Жидкостный хроматограф с ультрафиолетовым детектором (фирма Knauer, Германия).

Колонка стальная длиной 15 см, внутренним диаметром 4 мм, содержащая в качестве неподвижной фазы Диасфер 110-С18, зернением 5 мкм.

Температура колонки: комнатная.

Рабочая длина волны: 230 нм.

Чувствительность: 0,005 ед. абсорбции на шкалу.

Объем вводимой пробы: 20 куб. мм.

Линейный диапазон детектирования 1 - 10 нг.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор с концентрацией 0,5 мкг/куб. см, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

9.5.1. Исследование образцов винограда и сливы

Скорость потока элюента: 0,8 куб. см/мин.

Время удерживания феноксикарба: около 6 минут.

9.5.2. Исследование образцов яблок

Скорость потока элюента: 0,9 куб. см/мин.

Время удерживания феноксикарба: около 14 минут.

Содержание феноксикарба рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

Результат анализа представляют в виде:

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе "менее нижней границы определения"

менее 0,01 мг/кг <*> для яблок и слив и менее 0,05 мг/кг <**> для ягод и сока винограда.

--------------------------------

<*> 0,01 мг/кг - предел обнаружения для яблок и слив.

<**> 0,05 мг/кг - предел обнаружения для ягод и сока винограда.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6.2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):