"МУК 4.1.2407-08. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств метконазола в воде, почве, зерне, соломе зерновых, семенах, масле рапса методом капиллярной газожидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 17.07.2008)

1. Разработаны Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана.

2. Рекомендованы к утверждению комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 03.07.2008 N 2).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 17 июля 2008 г.

4. Введены в действие с 1 сентября 2008 г.

5. Введены впервые.

Настоящие Методические указания устанавливают метод газожидкостной хроматографии для определения остаточных количеств метконазола в воде, почве, зерне, соломе зерновых, семенах и масле рапса в диапазонах 0,003 - 0,03 мг/куб. дм; 0,01 - 1,0 мг/кг; 0,05 - 0,5 мг/кг; 0,01 - 1,0 мг/кг и 0,075 - 0,75 мг/кг соответственно.

(1RS,5RS;1RS,5SR)-5-(4-хлорбензил)-2,2-диметил-1-(1Н-1,2,4-триазол-1-илметил)циклопентанол (IUPAC).

Структурная формула (не приводится).

Область применения:

Метконазол - высокоэффективный системный фунгицид, проявляющий активность против фузариума, септорий, альтернарий, церкос-пореллы, мучнистой росы, применяемый на озимом рапсе, озимой пшенице и яровом ячмене путем наземного опрыскивания в период вегетации.

Рекомендуемые гигиенические нормативы:

ПДК в воде водоемов - 0,006 мг/куб. дм (общ.)

ОДК в почве - 0,2 мг/кг

При соблюдении всех регламентируемых условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерения при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в таблице 2.

Методика основана на определении метконазола с помощью капиллярной газожидкостной хроматографии (ГЖХ) с термоионным детектором (ТИД) после экстракции из анализируемых проб семян и масла рапса ацетонитрилом, почвы, зерна и соломы зерновых - смесью ацетон - гексан, воды - дихлорметаном, очистки экстрактов перераспределением в системе несмешивающихся растворителей и на колонке с силикагелем.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичной или более высокой квалификацией.

Допускается применение другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на газовом хроматографе.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией "лаборант", имеющего опыт работы в химической лаборатории.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °С и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление растворов, градуировочных растворов и растворов внесения, установление градуировочных характеристик, подготовка колонки с силикагелем, проверка хроматографического поведения метконазола на колонке.

7.1.1. Очистка гексана

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до тех пор, пока она не перестанет окрашиваться в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над поташом.

7.1.2. Очистка этилацетата

Этилацетат промывают последовательно 5%-ным водным раствором карбоната натрия, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над безводным карбонатом калия и перегоняют или подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретических тарелок не менее 50.

7.1.3. Очистка ацетонитрила

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора не менее 1 часа, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия.

7.2.1. Исходный раствор цис-метконазола для градуировки (концентрация 250 мкг/куб. см). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 0,025 г цис-метконазола, растворяют в 50 - 60 куб. см этилацетата, доводят этилацетатом до метки, тщательно перемешивают.

7.2.2. Исходный раствор транс-метконазола для градуировки (концентрация 250 мкг/куб. см). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 0,025 г транс-метконазола, растворяют в 50 - 60 куб. см этилацетата, доводят этилацетатом до метки, тщательно перемешивают.

Растворы хранят в морозильной камере при температуре < -15 °С в течение месяца.

7.2.3. Раствор N 1 цис-метконазола для градуировки (концентрация 10 мкг/куб. см). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 4 куб. см исходного раствора цис-метконазола с концентрацией 250 мкг/куб. см (п. 7.2.1), разбавляют этилацетатом до метки.

7.2.4. Раствор N 2 транс-метконазола для градуировки (концентрация 10 мкг/куб. см). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 4 куб. см исходного раствора транс-метконазола с концентрацией 250 мкг/куб. см (п. 7.2.2), разбавляют этилацетатом до метки.

Градуировочный раствор N 1 и 2 хранят в морозильной камере при температуре < -15 °С в течение месяца. Эти растворы используют для установления времени удерживания каждого изомера при хроматографировании.

7.2.5. Раствор N 3 цис-метконазола и транс-метконазола для градуировки (концентрация по 25 мкг/куб. см каждого изомера). В мерную колбу вместимостью 50 куб. см помещают по 5 куб. см исходных растворов цис- и транс-метконазола с концентрацией 250 мкг/куб. см (пп. 7.2.1 и 7.2.2), разбавляют этилацетатом до метки.

Раствор N 3 хранят в морозильной камере при температуре < -15 °С в течение 30-ти дней.

7.2.6. Рабочие растворы N 4 - 7 цис-метконазола и транс-метконазола для градуировки и внесения (концентрация по 2,5 - 0,25 мкг/куб. см каждого изомера). В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают по 1,0; 2,0; 4,0 и 10,0 куб. см градуировочного раствора N 3 с концентрацией 25 мкг/куб. см (п. 7.2.5), доводят до метки этилацетатом, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 4 - 7 с концентрацией цис- и транс-метконазола по 0,25, 0,5, 1,0 и 2,5 мкг/куб. см каждого изомера соответственно.

Растворы хранят в холодильнике при температуре 4 - 6 °С в течение 14-ти дней.

7.3.1. Исходные растворы цис- и транс-метконазола для внесения (концентрация 100 мкг/куб. см каждого изомера). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают по 0,01 г цис- и транс-метконазола, растворяют в 50 - 60 куб. см метанола (этилацетата), доводят метанолом (этилацетатом) до метки, тщательно перемешивают.

Растворы хранят в морозильной камере при температуре < -15 °С в течение месяца.

7.3.2. Растворы N 1 и 2 цис-метконазола и транс-метконазола для внесения (концентрация 5 мкг/куб. см каждого изомера). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 5 куб. см исходного раствора цис- и транс-метконазола с концентрацией 100 мкг/куб. см каждого изомера (пп. 7.3.1), разбавляют метанолом (этилацетатом) до метки.

Растворы N 1 и 2 хранят в морозильной камере при температуре < -15 °С в течение месяца.

Раствор в метаноле (N 1) используют для приготовления проб воды, почвы, зерна и соломы зерновых с внесением при оценке полноты извлечения метконазола методом "внесено - найдено", а также контроле качества результатов измерений методом добавок.

Раствор в этилацетате (N 2) используют для приготовления проб семян и масла рапса с внесением при оценке полноты извлечения метконазола методом "внесено - найдено", а также контроле качества результатов измерений методом добавок.

Градуировочные характеристики, выражающие линейную (с угловым коэффициентом) зависимость площади пика (мВ х сек.) от концентраций цис- и транс-изомеров метконазола в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4-м растворам для градуировки.

В испаритель хроматографа вводят по 1 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.5. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений. Устанавливают площади пиков двух изомеров метконазола.

Градуировочные графики проверяют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов. Если значения площадей отличаются более чем на 16% от данных, заложенных в градуировочную характеристику, ее строят заново, используя свежеприготовленные рабочие растворы для градуировки.

В мерную колбу вместимостью 500 куб. см помещают 40,5 г хлористого натрия, растворяют в 250 - 300 куб. см деионизованной воды, доводят водой до метки, тщательно перемешивают.

Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см, внутренним диаметром 12 мм уплотняют тампоном из стекловаты, выливают в колонку (при открытом кране) суспензию 4 г силикагеля в 20 куб. см гексана. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия массой 1 г. Колонка готова к работе.

В круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 0,5 куб. см раствора N 1 метконазола для внесения с концентрацией 5 мкг/куб. см каждого изомера (п. 7.3.6 или 7.3.6), упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре водяной бани не выше 35 °С. Сухой остаток растворяют в 0,5 куб. см этилацетата, помещают на ультразвуковую баню на 1 мин., добавляют 5 куб. см гексана, перемешивают и наносят на колонку, подготовленную по п. 7.6. Колбу обмывают 2,0 куб. см смеси гексан - этилацетат, которые также наносят на колонку. Промывают колонку последовательно 40 куб. см смеси гексан - этилацетат (8:2, по объему), 30 куб. см смеси гексан - этилацетат (1:1, по объему), элюаты отбрасывают.

Затем колонку промывают 60 куб. см этилацетата и 30 куб. см смеси этилацетат - метанол (3:1, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в сек. Фракционно (по 15 куб. см) отбирают элюат, упаривают, остатки растворяют в 1 куб. см этилацетата, анализируют содержание метконазола 9.5.

Фракции, содержащие метконазол, объединяют и вновь анализируют.

Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с колонки и необходимый для очистки объем элюента.

Примечание: Проверку хроматографического поведения метконазола следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии сорбентов и растворителей.

Отбор проб проводят в соответствии с требованиями: вода - ГОСТ Р 51592-2000 "Вода. Общие требования к отбору проб", почва - ГОСТ 1743.01-83 "Почва, общие требования к отбору проб", ГОСТ 26950-89 "Почвы. Отбор проб", зерно - ГОСТ 13586.3-83 "Зерно. Правила приемки и методы отбора проб", ГОСТ Р 50436-92 "Зерновые. Отбор проб зерна", солома - ОСТ 27262-87 "Корма растительного происхождения. Методы отбора проб", рапс - ГОСТ 10583-76 "Рапс. Требования при заготовках и поставках", ГОСТ 10852-86 "Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб", ГОСТ 8988-2002 "Масло рапсовое. Технические условия" и Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов (N 2051-79 от 21.08.79).

Отобранные пробы воды, почвы, зерна и соломы зерновых, семян рапса хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике не более недели. Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре -18 °С.

Пробы масла хранят в закрытой стеклянной таре при температуре 4 - 6 °С в темноте.

Перед анализом образцы воды фильтруют через неплотный бумажный фильтр, почвы - просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм, зерно и солому зерновых, семена рапса измельчают на лабораторной мельнице.

9.1.1. Экстракция

Образец отфильтрованной воды объемом 250 куб. см помещают в делительную воронку на 500 куб. см, добавляют 75 куб. см хлористого метилена, интенсивно встряхивают в течение 5 мин. После разделения фаз нижний органический слой отделяют, фильтруют через слой безводного сульфата натрия, помещенный на бумажном фильтре в конусной воронке, в круглодонную колбу вместимостью 500 куб. см. Операцию экстракции водной фазы повторяют дважды, используя по 75 куб. см хлористого метилена.

Объединенный экстракт упаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 35 °С и подвергают дополнительной очистке по п. 9.1.2.

9.1.2. Очистка экстракта на колонке с силикагелем

Остаток, полученный по п. 9.1.1, 9.2.2 или 9.3.2, находящийся в круглодонной колбе, растворяют в 0,5 куб. см этилацетата, помещая на ультразвуковую баню на 1 мин., добавляют 5 куб. см гексана, перемешивают. Затем раствор наносят на колонку, подготовленную по п. 7.6. Колбу обмывают дважды гексаном порциями по 2,5 куб. см, которые также наносят на колонку. Промывают колонку последовательно 50 куб. см гексана, 20 куб. см смеси гексан - этилацетат (9:1, по объему), элюаты отбрасывают.

Метконазол элюируют с колонки 60 куб. см этилацетата и 30 куб. см смеси этилацетат - метанол (3:1, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в сек., собирая элюат в круглодонную колбу вместимостью 150 - 250 куб. см, раствор упаривают досуха при температуре не выше 35 °С. Сухой остаток растворяют в 1,5 куб. см этилацетата (исследование воды), 4 куб. см этилацетата (исследование почвы), 2 куб. см этилацетата (исследование зерна зерновых), 1 куб. см этилацетата (исследование соломы зерновых), 3 куб. см этилацетата (исследование семян и масла рапса) и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.5.

9.2.1. Экстракция

Образцы почвы, измельченного зерна массой 20 г, соломы массой 5 г помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 куб. см, вносят 50 куб. см (для соломы - 75 куб. см) смеси ацетон - гексан (1:1, по объему), помещают на встряхиватель на 1 час. Полученный экстракт (надосадочная жидкость) осторожно декантируют, фильтруют на воронке Бюхнера через двойной бумажный фильтр "красная лента" под вакуумом. Осадок на фильтре возвращают в колбу и повторяют экстракцию дополнительной порцией смеси объемом 30 куб. см (для соломы 50 куб. см), выдерживая на встряхивателе 20 мин. Экстракт фильтруют на воронке Бюхнера с помощью разряжения, создаваемого водоструйным насосом, через бумажный фильтр "красная лента", осадок на фильтре промывают 10 куб. см этой же смеси.

Объединенный отфильтрованный экстракт переносят в делительную воронку на 500 куб. см (для соломы - 1000 куб. см) и проводят очистку экстракта по п. 9.2.2.

9.2.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей

К экстракту, полученному по п. 9.2.1 и помещенному в делительную воронку, добавляют 120 куб. см (солома - 160 куб. см) 7,5% раствора хлорида натрия и 50 куб. см этилацетата, интенсивно встряхивают в течение 2 - 3 мин. После разделения фаз верхний органический слой отделяют, фильтруют через слой безводного сульфата натрия, помещенный на бумажном фильтре в конусной воронке, в круглодонную колбу вместимостью 250 куб. см. Операцию экстракции водной фазы повторяют, используя 50 куб. см этилацетата. Объединенный экстракт упаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 35 °С и подвергают дополнительной очистке по п. 9.1.2.

Очищенную пробу перед хроматографированием растворяют при исследовании проб почвы в 4 куб. см этилацетата, зерна - 2 куб. см, соломы - 1 куб. см и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.5.

9.3.1. Экстракция

Образец измельченных семян массой 20 г помещают в коническую колбу вместимостью 250 куб. см, вносят 50 куб. см ацетонитрила и помещают на встряхиватель на 1 ч. Полученный экстракт (надосадочная жидкость) фильтруют на воронке Бюхнера с помощью разряжения, создаваемого водоструйным насосом, через двойной бумажный фильтр "красная лента". Осадок возвращают в коническую колбу и повторяют экстракцию дополнительной порцией ацетонитрила объемом 30 куб. см, выдерживая на встряхивателе 20 мин. Экстракт фильтруют на воронке Бюхнера с помощью разряжения, создаваемого водоструйным насосом, через бумажный фильтр "красная лента", осадок на фильтре промывают 10 куб. см ацетонитрила. Объединенный отфильтрованный экстракт подвергают очистке по п. 9.3.2.

9.3.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей

Объединенный отфильтрованный экстракт, полученный по п. 9.3.1 или 9.4.1, переносят в делительную воронку вместимостью 250 куб. см, добавляют 25 куб. см гексана (насыщенного ацетонитрилом), интенсивно встряхивают делительную воронку в течение 2-х мин. После полного разделения фаз нижний ацетонитрильный слой отделяют, перенося в коническую колбу. Верхний гексановый слой отбрасывают. Ацетонитрильную фазу вновь переносят в делительную воронку и повторяют операцию промывки, используя 25 куб. см гексана (насыщенного ацетонитрилом). Ацетонитрильный раствор переносят в круглодонную колбу вместимостью 150 куб. см, упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре водяной бани не выше 35 °С и подвергают очистке на колонке с силикагелем по п. 9.1.2. Очищенную пробу перед хроматографированием растворяют в 3 куб. см этилацетата и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.5.

9.4.1. Экстракция и очистка экстракта в системе несмешивающихся растворителей

Образец масла массой 10 г растворяют в 70 куб. см гексана и помещают в делительную воронку на 500 куб. см, вносят 30 куб. см ацетонитрила (насыщенного гексаном) и интенсивно встряхивают в течение 5 мин. После полного разделения фаз нижний ацетонитрильный слой осторожно декантируют через бумажный фильтр, помещенный в конусную воронку, в коническую колбу вместимостью 150 - 200 куб. см. Экстракцию пробы масла повторяют дважды дополнительными порциями ацетонитрила (насыщенного гексаном) объемом 25 куб. см.

Объединенный отфильтрованный экстракт переносят в делительную воронку на 250 куб. см, добавляют 25 куб. см гексана (насыщенного ацетонитрилом) и подвергают очистке по последовательно п. п. 9.3.2 и 9.1.2. Очищенную пробу перед хроматографированием растворяют в 1,5 куб. см этилацетата и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.5.

Хроматограф газовый "Кристалл-2000М" с термоионным детектором.

Колонка капиллярная ZB-50 длиной 30 м, внутренним диаметром 0,32 мм, толщина пленки сорбента 0,5 мкм.

Температура термостата колонки программированная. Начальная температура - 150 °С, выдержка - 1,3 мин., нагрев колонки со скоростью 25 градусов в минуту до температуры 280 °С, выдержка - 13,1 мин.

Скорость газа 1 (азот): 22,3 см/сек., давление 80 кПа, поток 0,67 куб. см/мин.

Газ 2: деление потока 1:13,4; сброс 8,9 куб. см/мин.

Водород: 12,5 куб. см/мин.

Воздух: 200 куб. см/мин.

Хроматографируемый объем: 1 куб. мм.

Пробу вводят в инжектор хроматографа не менее двух раз. Устанавливают площади пиков, с помощью градуировочных графиков определяют концентрацию цис- и транс-изомеров метконазола в хроматографируемом растворе.

Образцы, дающие пики, большие, чем градуировочные растворы цис-, транс-метконазола с концентрацией 2,5 мкг/куб. см, разбавляют этилацетатом, но не более чем в 50 раз.

Содержание метконазола в пробах воды, почвы, зерна, соломы зерновых, семян и масла рапса (Х, мг/куб. дм, мг/кг) рассчитывают по формуле:

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

При невыполнении условия выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

дельта - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, таблица 1), %.

Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание метконазола в пробе воды менее 0,003 мг/куб. дм, почвы, соломы зерновых - менее 0,1 мг/кг, зерна зерновых - 0,05 мг/кг, семян и масла рапса - менее 0,075 мг/кг" <*>.

--------------------------------

<*> 0,003 мг/куб. дм, 0,1 мг/кг, 0,05 мг/кг и 0,075 мг/кг - пределы обнаружения в воде, почве, соломе зерновых, зерне зерновых, семенах и масле рапса соответственно.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

где ДЕЛЬТА - граница абсолютной погрешности, мг/куб. дм или мг/кг:

дельта - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, таблица 1), %.

При невыполнении условия (1) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (1) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):