"МУК 4.1.2274-07. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств глюфосинат аммония и его метаболита в масле рапса методом капиллярной газожидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 24.09.2007)

1. Разработаны Всероссийским научно-исследовательским институтом фитопатологии.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол N 2 от 21.06.2007).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 24 сентября 2007 г.

4. Введены в действие с 10 декабря 2007 г.

5. Введены впервые.

Настоящие методические указания устанавливают метод газожидкостной хроматографии для определения массовой концентрации глюфосинат аммония и его метаболита 3-метилфосфино-пропионовой кислоты в масле рапса в диапазоне 0,2 - 2,0 мг/кг.

Название вещества по ИСО: Глюфосинат аммоний.

Название вещества по ИЮПАК: Аммоний DL-гомоаланин-4-ил-(метил)-фосфинат (I).

Глюфосинат аммоний не обладает тератогенным, канцерогенным и мутагенным действием. Он нетоксичен для водорослей, дафний, дождевых червей, пчел, птиц и диких животных.

Гигиенические нормативы для глюфосинат аммония в России:

ДСД - 0,02 мг/кг/сутки;

МДУ в растительных маслах - 0,4 мг/кг.

Область применения

Глюфосинат аммоний (I) - неселективный контактный гербицид с ограниченной системностью, передвигающийся только внутри обработанных листьев. В процессе поступления в растение вещество диссоциирует и в клетках присутствует только глюфосинат свободная кислота (II). Гербицид используется для уничтожения однолетних и многолетних широколистных и злаковых сорняков в парах, посадках плодовых и цитрусовых культур, ягодных кустарниках и виноградниках путем направленного опрыскивания в период активного роста сорных растений, а также на овощных культурах при довсходовом применении препарата. Глюфосинат аммоний применяется также для десикации ботвы картофеля, подсолнечника, клещевины, люцерны и сеникации яровой пшеницы.

Применяется в России в качестве десиканта на посевах гороха, подсолнечника, сои, рапса, люцерны и льна-долгунца при норме расхода от 0,15 до 0,35 кг д.в./га.

Глюфосинат аммоний в воде и растениях подвергается разрушению, в результате чего образуется 3-метилфосфино-пропионовая кислота (III).

Глюфосинат свободная кислота

Название по ИЮПАК: DL-гомоаланин-4-ил-(метил)-фосфиновая кислота (II)

Метаболит глюфосинат аммония

Название по ИЮПАК: 3-метилфосфино-пропионовая кислота (III)

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в таблице 2.

Методика основана на определении веществ с помощью газожидкостной хроматографии (ГЖХ) с термоионным детектором (ТИД) на фосфорсодержащие вещества. Контроль глюфосинат аммония и его метаболита 3-метилфосфино-пропионовой кислоты в образцах рапсового масла осуществляется по содержанию веществ после экстракции их из анализируемого образца водой, дериватизации веществ с помощью триметилортоацетата в кислой среде и последующей очистки полученных производных на колонке с силикагелем. В результате дериватизации глюфосинат аммоний превращается в метил-4-(метоксиметил)фосфинил-2-ацетамидобутират (IV), а метаболит - в метил-3-(метоксиметил)фосфинил-пропионат (V).

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Избирательность обеспечивается дериватизацией анализируемых веществ, подбором капиллярной колонки и условий программирования ее температуры.

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Глюфосинат аммоний (I), аналитический стандарт с содержанием д.в. 99,2% (Байер, Германия).

Глюфосинат свободная кислота (II), аналитический стандарт с содержанием д.в. 99,9% (Байер, Германия).

3-метилфосфино-пропионовая кислота (III), аналитический стандарт с содержанием д.в. 97,9% (Байер, Германия).

Метил-4-(метоксиметил)фосфино-2-ацетамидобутират (IV), аналитический стандарт с содержанием д.в. 98,9% (Байер, Германия).

Метил-3-(метоксиметил)фосфино-пропионат (V), аналитический стандарт с содержанием д.в. 98,8% (Байер, Германия).

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичной или более высокой квалификацией.

Допускается применение другого оборудования с аналогичными или лучшими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на газовом хроматографе.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией "лаборант", имеющего опыт работы в химической лаборатории.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 + 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики, подготовка колонки с силикагелем.

7.1.1. Очистка н-гексана

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до прекращения окрашивания последней в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над поташом.

7.1.2. Очистка метилацетата

Метилацетат промывают последовательно 5%-ным водным раствором карбоната натрия, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над безводным карбонатом калия, перегоняют.

7.1.3. Очистка силикагеля

Силикагель встряхивают с двойным объемом очищенного ацетона и затем фильтруют на воронке Бюхнера через бумажный фильтр. Силикагель на фильтре промывают 1,5 объемом ацетона и затем высушивают при температуре 130 °C в течение 5 часов.

В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 10 - 12 мм помещают тампон из стекловаты и в колонку (при открытом кране) медленно выливают суспензию 5 г силикагеля 1 степени активности в 10 куб. см метилацетата. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку промывают 10 куб. см метилацетата со скоростью 1 - 2 капли в сек., после чего она готова к работе.

В круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см помещают по 0,5 куб. см градуировочного раствора N 1 дериватов глюфосинат аммония и метаболита с концентрацией 10 мкг/куб. см в метилацетате (п. 7.6.2), раствор упаривают досуха, остаток растворяют в 3 куб. см метилацетата. Раствор наносят на колонку, подготовленную по п. 7.3. Промывают колонку 30 куб. см смеси метилацетат-метанол (95:5, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в сек., элюат отбрасывают. Затем колонку промывают 60 куб. см смеси метилацетат-метанол (8:2, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Фракционно (по 10 куб. см) отбирают элюат, упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре 40 °C до объема 0,5 - 1 куб. см. Раствор переносят в градуированную пробирку вместимостью 5 куб. см, колбу промывают 1 куб. см метилацетата, который также переносят в пробирку. Доводят метилацетатом объем в пробирке до 3 куб. см и анализируют на содержание дериватов по п. 9.4.

Примечание. При использовании новой партии сорбента или растворителей проводится проверка хроматографического поведения дериватов глюфосинат аммония и его метаболита.

Капиллярную кварцевую колонку ZB-50 (типа OV-17) устанавливают в термостат хроматографа и, не подсоединяя к детектору, кондиционируют при температуре 270 °C и скорости газа-носителя 2 куб. см/мин. в течение 8 - 10 часов.

7.6.1. Исходные растворы дериватов глюфосинат аммония и его метаболита (3-метилфосфино-пропионовая кислота) для градуировки (концентрация 100 мкг/куб. см в пересчете на эквивалент глюфосинат свободная кислота). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 13,9 мг метил-4-(метоксиметил)фосфинил-2-ацетамидобутирата (IV, дериват глюфосинат аммония) или 10 мг метил-3-(метоксиметил)фосфинил-пропионата (V, дериват метаболита), растворяют в 40 - 50 куб. см метанола, доводят метанолом до метки, тщательно перемешивают.

Растворы хранят в холодильнике в течение 6 месяцев.

7.6.2. Раствор смеси дериватов глюфосинат аммония и его метаболита N 1 для градуировки (концентрация каждого вещества 10 мкг/куб. см в пересчете на эквивалент глюфосинат свободная кислота). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см вносят по 10 куб. см исходных растворов дериватов глюфосинат аммония и метаболита с концентрацией 10 мг/куб. см (п. 7.6.1), разбавляют метилацетатом до метки.

Градуировочный раствор N 1 хранят в холодильнике в течение 3 месяцев.

7.6.3. Рабочие растворы N 2 - 5 смеси дериватов глюфосинат аммония и его метаболита для градуировки (концентрация каждого вещества 0,1 - 1,0 мкг/куб. см в пересчете на эквивалент глюфосинат свободная кислота). В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают по 1,0, 2,0, 5,0 и 10,0 куб. см градуировочного раствора N 1 смеси дериватов глюфосинат аммония и метаболита с концентрацией 10 мкг/куб. см (п. 7.6.2), доводят до метки метилацетатом, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 2 - 5 с концентрацией глюфосинат аммония и метаболита 0,1, 0,2, 0,5 и 1,0 мкг/куб. см.

Растворы хранят в холодильнике в течение месяца.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (мВ x сек.) от концентрации глюфосинат аммония или его метаболита в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 рабочим растворам дериватов веществ для градуировки.

В инжектор хроматографа вводят по 1 куб. мм каждого рабочего градуировочного раствора (п. 7.6.3) и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.4. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений.

Отвешивают 50,45 мг глюфосинат аммония в мерную колбу вместимостью 50 куб. см, добавляют 30 - 35 куб. см 0,015 М раствора водного аммиака, перемешивают до полного растворения вещества и доводят объем этим же растворителем до метки. Концентрация глюфосинат аммония в растворе (A) составляет 1 мг/куб. см в пересчете на эквивалент глюфосинат свободная кислота. Раствор A хранят в холодильнике не более месяца.

Отвешивают 42 мг 3-метилфосфино-пропионовой кислоты в мерную колбу вместимостью 50 куб. см, добавляют 30 - 35 куб. см 0,015 М раствора водного аммиака, перемешивают до полного растворения вещества и доводят объем этим же растворителем до метки. Концентрация метаболита в растворе (B) составляет 1 мг/куб. см в пересчете на эквивалент глюфосинат свободная кислота. Раствор B хранят в холодильнике не более месяца.

Переносят в мерную колбу вместимостью 50 куб. см по 0,5 куб. см растворов A и B и доливают ацетоном до метки, перемешивают. Концентрация глюфосинат аммония и его метаболита в растворе (C) составляет 10 мкг/куб. см в пересчете на эквивалент глюфосинат свободная кислота. Раствор хранят в холодильнике не более месяца.

Раствор C используют для приготовления проб рапсового масла с внесением при оценке полноты извлечения глюфосинат аммония и его метаболита из исследуемых образцов.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79) и правилами, определенными ГОСТом 10852-86 "Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб" и ГОСТом 8988-77 "Масло рапсовое. ТУ". Пробы рапсового масла хранят в плотно закрытой стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике при температуре 0 - 4 °C.

Навеску (5 г) масла помещают в коническую колбу вместимостью 250 куб. см, приливают 20 куб. см гексана, перемешивают и добавляют 80 куб. см деионизованной воды. Эмульсию перемешивают в течение 30 минут на аппарате для встряхивания и затем переносят в делительную воронку вместимостью 250 куб. см. Колбу ополаскивают 10 куб. см деионизованной воды, которые переносят в делительную воронку. После разделения фаз пропускают нижний водный слой через стеклянный фильтр с тампоном из хлопковой ваты в чистую делительную воронку вместимостью 250 куб. см. К водной фазе приливают 20 куб. см гексана и эмульсию встряхивают в течение 2 минут. После разделения фаз водный слой фильтруют через бумажный фильтр в мерный цилиндр. Измеряют объем раствора, отбирают 1/2 объема этой фракции (эквивалентна 2,5 г образца) в грушевидную колбу вместимостью 100 куб. см и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре 40 °C. Дальнейшую дериватизацию и очистку проводят по п. п. 9.2 и 9.3.

К сухому остатку (из п. 9.1) приливают 3 куб. см ледяной уксусной кислоты, перемешивают и колбу помещают в ультразвуковую ванну на 1 мин. Затем в колбу добавляют 12 куб. см триметилортоацетата и несколько стеклянных кипелок и снова помещают в ультразвуковую ванну на 1 мин. Реакционную смесь кипятят с обратным холодильником в течение 4,5 часов на электроплитке. К охлажденной реакционной смеси трижды добавляют по 15 куб. см толуола и каждый раз упаривают содержимое на ротационном вакуумном испарителе при температуре 40 °C до объема 1 - 2 куб. см. Дальнейшую очистку дериватов проводят по п. 9.3.

Примечание: При проведении дериватизации посуда и реактивы должны быть сухими.

К раствору дериватов глюфосинат аммония и метаболита в круглодонной колбе, полученного по п. 9.2, добавляют 2 куб. см смеси метилацетат-метанол (95:5, по объему) и раствор переносят на колонку с силикагелем, подготовленную по п. 7.3. Колбу обмывают дважды порциями по 2 куб. см смеси метилацетат-метанол (95:5, по объему), которые также наносят на колонку. Промывают колонку 30 куб. см смеси метилацетат-метанол (95:5, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в сек., элюат отбрасывают. Дериваты метаболита и глюфосинат аммония элюируют с колонки 50 куб. см смеси метилацетат-метанол (8:2, по объему), собирая элюат непосредственно в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. Элюат упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре 40 °C до объема 0,5 - 1 куб. см. Раствор переносят в градуированную пробирку вместимостью 5 куб. см, колбу обмывают дважды порциями по 1,5 куб. см метилацетата, которые также переносят в пробирку. Доводят метилацетатом объем в пробирке до 5 куб. см и анализируют на содержание дериватов глюфосинат аммония и метаболита по п. 9.4.

Колонка капиллярная кварцевая ZB-50 (типа OV-17), длина 30 м, внутренний диаметр 0,32 мм, толщина пленки 0,5 мкм, фирма Phenomenex (США).

Температура детектора - 300 °C, испарителя - 240 °C, колонки (программа: 150 °C - 2 мин.; 5°/мин. до 180 °C - 0 мин.; 12°/мин. до 250 °C - 4 мин.; 20°/мин. до 270 °C - 4 мин.).

Расход газов: газа-носителя (азот) - 2,7 куб. см/мин.; поддув детектора - 25 куб. см/мин.; водорода и воздуха в ТИД - 11,2 и 200 куб. см/мин., соответственно.

Деление потока: 1:2.

Объем вводимой пробы - 1 куб. мм.

Время удерживания метил-3-(метоксиметил)фосфинил-пропионата: 7 мин. 15 сек.

Время удерживания метил-4-(метоксиметил)фосфинил-2-ацетамидобутирата: 16 мин. 05 сек.

Линейный диапазон детектирования - 0,1 - 1 нг.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор с концентрацией 1,0 мкг/куб. см, разбавляют метилацетатом.

Содержание глюфосинат аммония (в пересчете на эквивалент глюфосинат свободная кислота) рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:

Результаты определения глюфосинат аммония и 3 метилфосфино-пропионовой кислоты суммируют и сравнивают с утвержденным значением МДУ для матрицы.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе "менее нижней границы определения" менее 0,2 мг/кг <*>.

--------------------------------

<*> 0,2 мг/кг - предел обнаружения глюфосинат аммония и метаболита.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

ВНИИ фитопатологии.