"МУК 4.1.2211-07. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств диметоморфа в ягодах винограда и виноградном соке методом капиллярной газожидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 25.05.2007)

1. Разработаны Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана.

2. Рекомендованы к утверждению комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол N 1 от 29.03.2007).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 25 мая 2007 г.

4. Введены впервые.

Настоящие Методические указания устанавливают метод капиллярной газожидкостной хроматографии для определения массовой концентрации диметоморфа в ягодах винограда и виноградном соке в диапазоне 0,05 - 0,5 мг/кг.

Диметоморф - действующее вещество препарата АКРОБАТ МЦ, ВДГ (600 + 90 г/кг), д.в. манкоцеб + диметоморф, фирма - производитель "БАСФ".

(Е,Z)-4-[3-(4-(хлорфенил)-3-(3,4-диметоксифенил)акрилоил]морфолин (IUPAC).

Структурная формула (не приводится).

Мол. масса 387,9.

Смесь (Е)- и (Z)-изомеров в соотношении 1:1.

Область применения препарата

Диметоморф - системный фунгицид для борьбы с заболеваниями, вызываемыми оомицетами, особенно с возбудителями милдью винограда и фитофтороза картофеля и томатов.

ВМДУ диметоморфа в винограде - 0,1 мг/кг.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в таблице 2.

Методика основана на определении вещества с помощью капиллярной газожидкостной хроматографии (ГЖХ) с детектором электронного захвата ионов после экстракции из анализируемых пробы ягод винограда и виноградного сока ацетоном, очистки экстракта перераспределением между двумя несмешивающимися фазами и на колонке с флорисилом.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки. Нижний предел измерения в хроматографируемом объеме пробы: 0,25 нг.

В предлагаемых условиях метод специфичен в присутствии 2-го действующего вещества - манкоцеба, его метаболита этилентиомочевины (ЭТМ), а также компонентов препаративной формы.

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Допускается применение хроматографических колонок и другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на газовом хроматографе.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией "лаборант", имеющего опыт работы в химической лаборатории.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °С и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление растворов, градуировочных растворов, раствора внесения, установление градуировочной характеристики, подготовка колонки с флорисилом для очистки экстракта, проверка хроматографического поведения вещества на колонке.

7.1.1. Ацетон

7.1.2. Ацетонитрил

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора не менее 1 часа, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия.

7.1.3. н-Гексан

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты, до тех пор, пока она не перестанет окрашиваться в желтый цвет, водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над поташом.

7.1.4. Метилен хлористый

Растворитель промывают последовательно 5%-ным водным раствором карбоната натрия, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над безводным карбонатом калия и перегоняют или подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретических тарелок не менее 50.

В мерную колбу вместимостью 500 куб. см помещают 25 г хлористого натрия, растворяют в 300 - 350 куб. см дистиллированной воды, доводя водой до метки, тщательно перемешивают.

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 800 куб. см гексана и 200 куб. см ацетона, тщательно перемешивают.

7.4.1. Исходный раствор диметоморфа для градуировки (концентрация 100 мкг/куб. см). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 0,01 г диметоморфа, растворяют в 50 - 70 куб. см ацетона, доводят до метки этим же растворителем, тщательно перемешивают. Раствор хранится в холодильнике (4 - 6 °С) в темноте в течение месяца.

Рабочие градуировочные растворы диметоморфа готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходного раствора.

7.4.2. Раствор N 1 диметоморфа для градуировки и внесения (концентрация 10 мкг/куб. см). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 10 куб. см исходного раствора диметоморфа с концентрацией 100 мкг/куб. см (п. 7.4.1), разбавляют ацетоном до метки. Раствор хранится в холодильнике в темноте в течение месяца.

Этот раствор используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения диметоморфа из исследуемых образцов методом "внесено-найдено".

7.4.3. Рабочие растворы N 2 - 5 для градуировки (концентрация 0,25 - 2,5 мкг/куб. см). В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают по 2,5; 5,0; 10,0 и 25,0 куб. см раствора N 1 с концентрацией 10 мкг/куб. см (п. 7.4.2), доводят до метки смесью гексан - ацетон (8:2, по объему), приготовленной по п. 7.3, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 2 - 5 с концентрацией диметоморфа 0,25; 0,5; 1,0 и 2,5 мкг/куб. см соответственно. Растворы хранятся в холодильнике (в темноте) в течение 10-ти дней.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость суммы площадей хроматографических пиков (Е)- и (Z)-изомеров (мВ х сек.) от концентрации диметоморфа в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4-м растворам для градуировки N 2 - 5.

В испаритель хроматографа вводят 1 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.4. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений.

Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 30 см, внутренним диаметром 13 - 15 мм уплотняют тампоном из стекловаты, выливают в колонку (при открытом кране) суспензию 5 г флорисила (предварительно дезактивированного 4% по массе деионизованной воды) в 20 куб. см гексана. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента. Колонка готова к работе.

В круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 0,5 куб. см раствора N 1 для градуировки с концентрацией диметоморфа 10 мкг/куб. см (п. 7.4.2), растворитель упаривают досуха. Остаток растворяют в 5 куб. см смеси гексан - ацетон (8:2, по объему) и наносят на колонку, подготовленную по п. 7.6. Колбу обмывают 3 куб. см этой же смеси, которые также наносят на колонку. Промывают колонку 160 куб. см смеси гексан - ацетон (8:2, по объему), первые 50 куб. см элюата отбрасывают.

Далее элюат отбирают фракционно (по 10 куб. см), упаривают, остатки растворяют в 2 куб. см смеси генсан - ацетон (8:2, по объему), анализируют по п. 9.4.

Фракции, содержащие диметоморф, объединяют и вновь анализируют.

Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с колонки и необходимый объем элюента.

Примечание: Проверку хроматографического поведения вещества следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии сорбентов и растворителей.

Отбор проб производится в соответствии с правилами, определенными ГОСТами 25896-83 "Виноград свежий столовый, ТУ", 28472-90 "Виноград свежий ручной уборки для консервирования. Требования при заготовках и поставках", 26313-84 "Продукты переработки плодов и овощей", "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79).

Отобранные пробы ягод винограда и виноградного сока хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике не более 10-ти дней. Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре -18 °С.

9.1.1. Виноград (ягоды)

Образец измельченных ягод винограда массой 25 г помещают в коническую колбу вместимостью 250 куб. см, вносят 100 куб. см ацетона, гомогенизируют в течение 3-х минут, затем помещают на встряхиватель на 30 мин. Экстракт фильтруют через складчатый бумажный фильтр, декантируя в мерный цилиндр вместимостью 250 куб. см с пришлифованной пробкой. Экстракцию пробы повторяют новой порцией ацетона объемом 80 куб. см, встряхивая 20 мин. Экстракт также фильтруют в мерный цилиндр, промывая остаток на фильтре 20 куб. см ацетона.

Доводят общий объем раствора в цилиндре до 250 куб. см ацетоном, перемешивают. Аликвоту раствора объемом 100 куб. см (соответствующую 10 г анализируемого образца) переносят в колбу для упаривания вместимостью 250 куб. см, добавляют 20 куб. см деионизованной воды, концентрируют на ротационном вакуумном испарителе (при температура 35 - 40 °С) до водного остатка (около 25 куб. см) и подвергают очистке по п. 9.2.

9.1.2. Виноградный сок

К образцу виноградного сока массой 25 г в конической колбе (с пришлифованной пробкой) вместимостью 250 куб. см добавляют 100 куб. см ацетона, интенсивно встряхивают в течение 5 мин., помещают в холодильник (4 °С) на 1 час. Экстракт фильтруют через складчатый бумажный фильтр в мерный цилиндр вместимостью 250 куб. см, промывая остаток на фильтре 20 куб. см ацетона.

Доводят общий объем раствора в цилиндре до 250 куб. см ацетоном, перемешивают. Аликвоту раствора объемом 100 куб. см (соответствующую 10 г анализируемого образца) переносят в колбу для упаривания вместимостью 250 куб. см, добавляют 20 куб. см деионизованной воды, концентрируют на ротационном вакуумном испарителе (при температура 35 - 40 °С) до водного остатка (около 25 куб. см) и подвергают очистке по п. 9.2.

Водный остаток, полученный по п. 9.1.1 или 9.1.2, переносят в делительную воронку вместимостью 150 куб. см. Колбу ополаскивают 30 куб. см ацетонитрила, который также переносят в делительную воронку. Вносят в воронку 30 куб. см гексана, 10 куб. см 5%-ного водного раствора хлористого натрия, интенсивно встряхивают в течение 5-ти мин. После полного разделения фаз верхний органический слой отделяют и отбрасывают. Водную фракцию возвращают в делительную воронку и операцию промывки встряхиванием ее в течение 5-ти мин. с гексаном порциями по 30 куб. см повторяют еще дважды. Верхние гексановые слои отбрасывают. Нижнюю водную фазу вновь возвращают в делительную воронку, вносят 30 куб. см дихлорметана, интенсивно встряхивают 5 мин. После разделения фаз нижний органический слой отделяют, фильтруя через безводный сульфат натрия (20 г), помещенный на бумажном фильтре в конусной воронке, в круглодонную колбу вместимостью 150 куб. см. Операцию экстракции повторяют новой порцией дихлорметана объемом 30 куб. см, встряхивая в течение 5 мин. Объединенную органическую фазу, пропущенную через слой сульфата натрия, упаривают досуха и подвергают дополнительной очистке на колонке по п. 9.3.

Остаток в круглодонной колбе, полученный по п. 9.2, растворяют в 5 куб. см смеси гексан - ацетон (8:2, по объему), раствор наносят на колонку, подготовленную по п. 7.6. Колбу обмывают дважды этой же смесью порциями по 3 куб. см, которые также наносят на колонку. Промывают колонку со скоростью 1 - 2 капли в сек. 160 куб. см смеси гексан - ацетон (8:2, по объему), первые 50 куб. см элюата отбрасывают.

Последующие 110 куб. см элюата собирают в круглодонную колбу вместимостью 250 куб. см. Раствор упаривают досуха при температуре не выше 35 °С, остаток в колбе растворяют в 2 куб. см смеси гексан - ацетон (8:2, по объему), анализируют содержание диметоморфа по п. 9.4.

Измерения выполняют при следующих режимных параметрах:

Газовый хроматограф "Кристалл-2000М", снабженный детектором электронного захвата ионов.

Колонка капиллярная ZB-5 длиной 15 м, внутренним диаметром 0,53 мм, толщина пленки сорбента 0,5 мкм.

Температура термостата колонки программированная. Начальная температура - 100 °С, выдержка 1 мин., нагрев колонки со скоростью 25 градусов в минуту до температуры 280 °С, выдержка - 5 минут, нагрев колонки со скоростью 50 градусов в минуту до температуры 300 °С, выдержка - 4 минуты.

Скорость газа 1 (азот): 30 см/сек., давление 11,399 кПа, поток 4,0547 куб. см/мин.

Газ 2: деление потока 1:2,017; сброс 8,179 куб. см/мин.

Хроматографируемый объем: 1 куб. мм.

Ориентировочное время выхода диметоморфа:

(Z)-изомер - 11 мин. 56 сек.

(Е)-изомер - 12 мин. 23 сек.

Линейный диапазон детектирования 0,25 - 2,5 нг.

Образцы, дающие пики большие, чем градуировочный раствор диметоморфа с концентрацией 2,5 мкг/куб. см, разбавляют смесью гексан - ацетон (8:2, по объему) не более чем в 50 раз.

Содержание диметоморфа в пробе (Х, мг/кг) рассчитывают по формуле:

где:

С - концентрация диметоморфа, найденная по градуировочному графику в соответствии с величиной суммы площадей хроматографических пиков (Е)- и (Z)-изомеров, мкг/куб. см;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;

m - масса анализируемого образца, г.

К = 2,5 (с учетом объема экстракта, взятого для анализа).

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

где дельта - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, таблица 1), %.

Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде: "содержание диметоморфа в пробе менее 0,05 мг/кг" <*>.

--------------------------------

<*> 0,05 мг/кг - предел обнаружения.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

где дельта - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном определяемых концентраций, таблица 1), %.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):