"МУК 4.1.2116-06. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение массовой концентрации стирола в пробах крови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 09.08.2006)

Методические указания по определению концентрации стирола в крови предназначены для использования Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, лечебными и научными учреждениями, работающими в области профпатологии и экологии человека, научно-исследовательскими институтами, занимающимися вопросами гигиены окружающей среды.

Методические указания разработаны с целью обеспечения контроля за содержанием стирола в биологических средах у населения, проживающего в районах с повышенным уровнем загрязнения окружающей среды.

Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ Р 8.563-96 "ГСОЕИ. Методики выполнения измерений", ГОСТ Р 1.5-92 "ГСС. Общие требования к построению, изложению, оформлению и содержанию стандартов". Методика выполнения измерений обеспечивает определение стирола в диапазоне концентраций 0,1 - 5,0 мкг/куб. см с погрешностью, не превышающей 23%, при доверительной вероятности Р = 0,95.

Стирол (винилбензол, фенилэтилен) - бесцветная жидкость с резким запахом. Температура кипения: 145 °С, плотность 0,9059. Растворяется в большинстве органических растворителей, растворимость в воде 0,032% по объему (20 °С) [1]. Стирол оказывает общетоксическое, сенсибилизирующее, эмбриотропное, раздражающее действия, отрицательно влияет на ЦНС, обладает кумулятивным эффектом [2].

Методика основана на извлечении стирола из крови экстракцией гексаном и анализе экстракта на жидкостном хроматографе.

Измерение концентрации стирола выполняют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием УФ-детектора.

Нижний предел измерения - 0,001 мкг.

Определению не мешают фенол, бензол, толуол, этилбензол, ксилолы, карбоновые кислоты.

Длительность анализа, включая пробоподготовку, - 20 мин.

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, материалы и реактивы.

Элюент для хроматографии

Раствор гидроксида натрия, 10%-й

Раствор дихромата калия в серной кислоте, 3%-й.

Допускается применение других типов средств измерений, вспомогательного оборудования, химреактивов и материалов, по метрологическим и техническим характеристикам не уступающих перечисленным.

4.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.007-76 и ГОСТ 12.1.005-88.

4.2. При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79, противопожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и меры безопасности, указанные в "Руководстве по правилам эксплуатации прибора".

К выполнению измерений допускаются лица, имеющие квалификацию не ниже инженера-химика и владеющие техникой жидкостно-хроматографического анализа.

6.1. При подготовке проб к анализу и приготовлении растворов соблюдают следующие условия:

- температура воздуха 15 - 25 °С;

- атмосферное давление 630 - 800 мм рт. ст.;

- влажность воздуха не более 80% при температуре 25 °С.

6.2. Выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендуемых технической документацией к прибору.

Перед выполнением измерений проводят следующие работы: подготовка посуды, приготовление растворов, подготовка хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики.

Используемую посуду замочить на 1 ч в свежеприготовленном 3%-м растворе двухромовокислого калия в серной кислоте, отмыть в проточной водопроводной воде, ополоснуть дистиллированной водой и просушить при температуре 120 °С.

7.2.1. Элюент для хроматографии. Смешивают 60 куб. см ацетонитрила с 40 куб. см дистиллированной воды. Подвижную фазу фильтруют через воронку Шотта (пор 16) и дегазируют барботированием гелия в течение 3 - 5 мин. со скоростью 50 - 60 куб. см/мин.

7.2.2. Раствор гидроксида натрия 10%-й. Вносят в мерный стакан с меткой на 100 куб. см 10 г гидроксида натрия, прибавляют 90 куб. см дистиллированной воды и перемешивают содержимое стакана до полного растворения гидроксида натрия. Срок хранения раствора - 30 дней при 4 °С.

7.2.3. Раствор двухромовокислого калия в серной кислоте 3%-й. Растворяют 3,0 г двухромовокислого калия в 53 куб. см концентрированной серной кислоты (плотность 1,84). Использовать свежеприготовленный раствор.

Колонку устанавливают в хроматограф и подают элюирующую жидкость, подготовленную в соответствии с п. 7.2.1, со скоростью 0,6 куб. см/мин. до установления равновесия колонки, которое определяют по стабильности нулевой линии детектора.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика на хроматограмме от концентрации стирола в крови, устанавливают по шести сериям растворов для градуировки. Каждую серию, состоящую из трех растворов, готовят разбавлением аттестованной смеси стирола в этиловом спирте (растворы А, Б).

7.4.1. Приготовление раствора А: 1 куб. см аттестованной смеси стирола в этиловом спирте с концентрацией 1,0 мг/куб. см вносят в мерную колбу вместимостью 100 куб. см и доводят дистиллированной водой до метки. Используют свежеприготовленный раствор.

7.4.2. Приготовление раствора Б: 10 куб. см аттестованной смеси стирола в этиловом спирте с концентрацией 1,0 мг/куб. см вносят в мерную колбу вместимостью 100 куб. см и доводят дистиллированной водой до метки. Используют свежеприготовленный раствор.

7.4.3. В соответствии с п. 8 проводят анализ образца крови на отсутствие стирола. Объем образца крови для приготовления градуировочных смесей должен быть не менее 12 куб. см. Образец крови с гепарином (из расчета 0,05 куб. см гепарина на 2 куб. см крови) может храниться 2 дня при температуре 4 °С.

7.4.4. Для установления градуировочной характеристики в 2 куб. см крови добавляют 0,05 куб. см раствора гепарина, вносят раствор А или Б в соответствии с табл. 1 и помещают в делительную воронку, в которую добавляют 40 куб. см дистиллированной воды, 0,2 куб. см 10%-го раствора щелочи NaOH и 2 куб. см гексана. Содержимое воронки перемешивают экстрактором со скоростью 2500 об./мин. в течение 45 с. После расслоения жидкостей переносят гексановый экстракт в центрифужную пробирку с крышкой и центрифугируют в течение 5 мин. при скорости 1500 об./мин. Аликвотную часть экстракта в количестве 10 куб. мм вводят в колонку хроматографа и анализируют в рабочем режиме прибора.

Градуировку проверяют 1 раз в квартал и при смене партии реактивов.

Отбор проб венозной крови в объеме 4 куб. см производят в тщательно вымытую стеклянную пробирку с притертой пробкой, в которую предварительно вносят 0,1 куб. см раствора гепарина. Срок хранения проб в холодильнике - не более 2-х суток.

Проводят два параллельных измерения образца крови: 2 куб. см крови помещают в делительную воронку, в которую добавляют 40 куб. см дистиллированной воды, 0,2 куб. см 10%-го раствора щелочи NaOH и 2 куб. см гексана. Перемешивают содержимое воронки экстрактором со скоростью 2500 об./мин. в течение 45 с. После расслоения жидкостей переносят гексановый экстракт в центрифужную пробирку с завинчивающейся крышкой и центрифугируют в течение 5 мин. при скорости 1500 об./мин. Аликвотную часть экстракта в количестве 10 куб. мм вводят в колонку хроматографа и анализируют в рабочем режиме хроматографа, указанном в п. 7.4.4.

Идентификация хроматографического пика стирола проводится путем сопоставления времен удерживания хроматографических пиков в стандартном растворе стирола и в анализируемой пробе.

Внутренний контроль качества (ВКК) результатов измерений - повторяемость, внутрилабораторная прецизионность (воспроизводимость), точность - осуществляют с целью получения оперативной информации о качестве результатов измерений и принятия при необходимости оперативных мер по его повышению в соответствии с нормативным документом МИ 2335-2003 "ГСОЕИ. Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа".

Методика выполнения измерений обеспечивает получение результатов измерений с нормативами, не превышающими значений, приведенных в табл. 2 и 3.

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят 1 раз в квартал в анализируемой серии измерений. Определяют содержание исследуемого соединения в градуировочных растворах, которые соответствует началу, середине и концу диапазона измерений. Градуировка признается стабильной, если расхождение между заданным и измеренным значением концентраций не превышает 5%.

Если условие не выполняется, эксперимент повторяют. При повторном получении отрицательного результата выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.

Внутренний контроль качества воспроизводимости проводят с использованием рабочей пробы. Пробу делят на две равные части и анализируют в соответствии с методикой, максимально варьируя условия проведения анализа (разные операторы, разное время, разные партии реактивов одного типа, разные наборы мерной посуды и т.д.). Воспроизводимость результатов контрольных измерений признают удовлетворительной, если выполняется условие:

Если условие не выполняется, эксперимент повторяют. При повторном получении отрицательного результата выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.

При превышении норматива контроля точности эксперимент повторяют. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам контроля, и устраняют их.

Периодичность контроля воспроизводимости и точности регламентируется в руководстве по качеству лаборатории.

1. Химическая энциклопедия/Под. ред. Н.С. Зефирова. М.: "Большая российская энциклопедия", 1995. Т. 4.

2. Лазарев Н.В. Вредные вещества в промышленности. Органические вещества: Справочник. М.: "Химия", 1976. Т. 1. С. 113 - 117.

Методические указания разработаны Пермским научно-исследовательским клиническим институтом детской экопатологии (Т.С. Уланова, Т.Д. Карнажицкая).