"МУК 4.1.2011-05. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методические указания по определению остаточных количеств Фенаримола в воде, почве, ягодах винограда и виноградном соке методом газожидкостной хроматографии"
(утв. Роспотребнадзором 17.10.2005)

1. Подготовлены Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана при участии специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко.

4. Введены впервые.

Настоящие Методические указания устанавливают метод газожидкостной хроматографии для определения в воде, почве, ягодах винограда и виноградном соке массовых концентраций фенаримола в диапазонах 0,00002 - 0,0002 мг/куб. дм (вода); 0,02 - 0,2 мг/кг (почва, виноград, виноградный сок).

Фенаримол - действующее вещество препарата РУБИГАН, КЭ (120 г/л), фирма-производитель "Кромптон" (Англия).

(+/-)-2,4'-дихлор-альфа-(пиримидин)бензгидриловый спирт (IUPAC).

Структурная формула (не приводится).

Мол. масса 331.2.

Кристаллическое вещество беловатого цвета со слабым ароматическим запахом. Плотность 1,4 (при 25 °С). Температура плавления кипения 117 - 119 °С. Давление паров при 25 °С: 0,065 мПа. Хорошо растворим в большинстве органических растворителей, за исключением гексана. Растворимость в ацетоне - 151; метаноле - 98; ксилоле - 33,3 г/куб. дм (при 20 °С); в воде - 13,7 мг/куб. дм (при 20 °С).

Область применения препарата:

Фенаримол - фунгицид класса пиримидина, рекомендуемый для борьбы с паршой и мучнистой росой на яблоне, груше, ягодниках; для обработки виноградной лозы от оидиума.

Гигиенические нормативы: ПДК в воде водоемов - 0,00002 мг/куб. дм; ПДК в почве - 0,04 мг/кг; МДУ в винограде - 0,1 мг/кг.

Метрологические характеристики метода представлены в таблицах 1 и 2.

Методика основана на определении вещества с помощью газожидкостной хроматографии (ГЖХ) с детектором электронного захвата ионов (ДЭЗ) после экстракции из анализируемой пробы воды хлористым метиленом, почвы - смесью ацетон - вода, ягод винограда и виноградного сока - ацетонитрилом, очистки экстракта перераспределением между двумя несмешивающимися фазами (почва, растительный материал) и на колонке с оксидом алюминия.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

Нижний предел измерения в хроматографируемом объеме пробы: 0,02 нг.

В предлагаемых условиях определения метод специфичен в присутствии пестицидов, применяемых в технологии выращивания винограда.

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичной или более высокой квалификацией.

Допускается применение хроматографических колонок и другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно-допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на газовом хроматографе.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией "лаборант", имеющего опыт работы в химической лаборатории.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °С и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление градуировочных растворов, установление градуировочной характеристики, подготовка колонки с оксидом алюминия для очистки экстракта, проверка хроматографического поведения вещества на колонке.

7.1.1. Очистка ацетона

7.1.2. Очистка ацетонитрила

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора не менее 1 часа, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия.

7.1.3. Очистка этилацетата

Этилацетат промывают последовательно 5%-ным водным раствором карбоната натрия, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над безводным карбонатом калия и перегоняют или подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретических тарелок не менее 50.

7.1.4. Очистка н-гексана и хлористого метилена

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до тех пор, пока она не перестанет окрашиваться в желтый цвет, водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над поташом.

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 800 куб. см ацетона и 200 куб. см дистиллированной воды, тщательно перемешивают.

В мерную колбу вместимостью 500 куб. см помещают 25 г хлористого натрия, растворяют в 300 - 350 куб. см дистиллированной воды; доводя водой до метки, тщательно перемешивают.

7.4.1. Исходный раствор фенаримола (концентрация 100 мкг/куб. см)

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 0,01 г фенаримола, растворяют в 50 - 70 куб. см ацетона, доводят ацетоном до метки, тщательно перемешивают. Раствор хранится в холодильнике в течение месяца.

Растворы N 1 - 5 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходного раствора.

7.4.2. Раствор N 1 фенаримола (концентрация 10 мкг/куб. см)

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 10,0 куб. см исходного раствора с концентрацией 100 мкг/куб. см (п. 7.4.1), доводят до метки ацетоном, тщательно перемешивают.

Раствор хранится в холодильнике в течение месяца.

Этот раствор используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения фенаримола из исследуемых образцов.

7.4.3. Рабочие растворы N 2 - 5 фенаримола для градуировки (концентрация 0,02 - 0,2 мкг/куб. см)

В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают по 0,2, 0,4, 1,0 и 2,0 куб. см раствора N 1 с концентрацией 10 мкг/куб. см (п. 7.4.2), доводят до метки ацетоном, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 2 - 5 с концентрацией фенаримола 0,02, 0,04, 0,1 и 0,2 мкг/куб. см соответственно.

Растворы хранятся в холодильнике не более 2-х недель.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади (высоты) пика от концентрации фенаримола в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4-м растворам для градуировки N 2 - 5.

В испаритель хроматографа вводят по 1 куб. мм каждого градуировочного раствора N 2 - 5 и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.5. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений.

Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см, внутренним диаметром 8 - 10 мм уплотняют тампоном из стекловаты, медленно выливают в колонку (при открытом кране) суспензию 5 г оксида алюминия в 15 - 20 куб. см смеси гексан - этилацетат (1:1, по объему). Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1,5 см. После этого колонка готова к работе.

В круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 2 куб. см раствора N 5 для градуировки с концентрацией фенаримола 0,2 мкг/куб. см (п. 7.4.3), растворитель упаривают досуха. Остаток растворяют в 2 куб. см этилацетата (помещая колбу в ультразвуковую баню на 30 сек.), добавляют 2 куб. см гексана, перемешивают (вновь помещая колбу в ультразвуковую баню на 30 сек.) и наносят на колонку, подготовленную по п. 7.6. Колбу обмывают трижды порциями смеси гексан - этилацетат (1:1) по 3 куб. см, которые также наносят на колонку. Промывают колонку последовательно порциями по 30 куб. см вначале смесью состава гексан - этилацетат (1:1, по объему), затем этой же смесью в соотношении 2:8 (по объему) и этилацетатом, элюат отбрасывают.

Затем колонку промывают 100 куб. см смеси этилацетат - метанол (9:1, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в сек. Фракционно (по 10 куб. см) отбирают элюат, упаривают, остатки растворяют в 1 куб. см ацетона, анализируют по п. 9.5.

Фракции, содержащие фенаримол, объединяют и вновь анализируют.

Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с колонки и необходимый объем элюента.

Примечание: Проверку хроматографического поведения фенаримола следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии сорбентов и растворителей.

Отбор проб производится в соответствии с правилами, определенными ГОСТами Р 51592-2000, 1743.01-83, 26950-89, 25896-83, 26318-84 и 28472-90.

Отобранные пробы воды анализируют в день отбора или хранят при 4 °С в течение 30-ти дней.

Отобранные пробы ягод винограда и виноградного сока хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике не более 10-ти дней. Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре -18 °С.

Для длительного хранения пробы почвы подсушивают при комнатной температуре в отсутствии прямого солнечного света. Сухие почвенные образцы могут храниться в течение 3-х месяцев.

Перед анализом образцы ягод винограда измельчают, воду фильтруют через неплотный бумажный фильтр, сухую почву просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм.

Образец анализируемой воды объемом 1000 куб. см помещают в делительную воронку вместимостью 1500 куб. см, вносят 20 г хлористого натрия, перемешивают до полного растворения соли, добавляют 100 куб. см хлористого метилена, интенсивно встряхивают делительную воронку в течение 2-х мин. После полного разделения фаз нижний органический слой переносят в круглодонную колбу вместимостью 500 куб. см, фильтруя его через 2-х см слой безводного сульфата натрия, помещенный в конусную химическую воронку диаметром 60 мм, снабженную бумажным фильтром "красная лента". Операцию экстракции водной фазы повторяют еще дважды порциями хлористого метилена по 70 куб. см. Отстоявшийся слой хлористого метилена (нижняя фаза) фильтруют в колбу с ранее полученным экстрактом.

Объединенный экстракт упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °С, подвергают очистке в соответствии с п. 9.2.3.

9.2.1. Экстракция

Образец суховоздушной почвы массой 20 г помещают в круглодонную колбу вместимостью 250 куб. см, вносят 100 куб. см смеси ацетон - вода (8:2, по объему), подсоединяют обратный холодильник и помещают на 30 мин. на водяную баню, нагретую до 80 °С. После охлаждения раствор переносят в мерный цилиндр вместимостью 250 куб. см, фильтруя его через складчатый фильтр "красная лента". Осадок промывают дважды смесью ацетон - вода (8:2, по объему) порциями по 30 куб. см. Промывки также фильтруют в мерный цилиндр, объединяя с экстрактом. Содержимое цилиндра перемешивают, измеряют его объем; 1/10 часть раствора (соответствующую 2 г анализируемого образца) переносят в круглодонную колбу, упаривают до водного остатка (~ 4 куб. см) и подвергают очистке по п. 9.2.2.

9.2.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей

Водный остаток, полученный по п. 9.2.1, переносят в делительную воронку вместимостью 250 куб. см. Колбу ополаскивают 50 куб. см 5%-ного раствора хлористого натрия, который также переносят в делительную воронку. Вносят в делительную воронку 20 куб. см хлористого метилена, интенсивно встряхивают в течение 2-х мин. После полного разделения фаз нижний органический слой отделяют, фильтруют через слой безводного сульфата натрия, помещенный на бумажном фильтре в конусной воронке, в круглодонную колбу вместимостью 150 куб. см. Операцию экстракции повторяют еще дважды, используя по 20 куб. см хлористого метилена. Объединенную органическую фазу, пропущенную через слой сульфата натрия, упаривают досуха и подвергают дополнительной очистке на колонке по п. 9.2.3.

9.2.3. Очистка экстракта на колонке с оксидом алюминия

Остаток в круглодонной колбе, полученный после упаривания (п. 9.2.2) растворяют в 2 куб. см этилацетата (помещая колбу в ультразвуковую баню на 30 сек.), добавляют 2 куб. см гексана, перемешивают (вновь помещая колбу в ультразвуковую баню на 30 сек.) и наносят на колонку, подготовленную по п. 7.6. Колбу обмывают трижды порциями смеси гексан - этилацетат (1:1) по 3 куб. см, которые также наносят на колонку. Промывают колонку последовательно порциями по 30 куб. см вначале смесью состава гексан - этилацетат (1:1, по объему), затем этой же смесью в соотношении 2:8 (по объему) и этилацетатом, элюат отбрасывают.

Фенаримол элюируют с колонки 60 куб. см смеси этилацетат - метанол (9:1, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в сек., собирая элюат в круглодонную колбу. Раствор упаривают досуха при температуре не выше 35 °С, остаток в колбе растворяют в 2 куб. см ацетона при исследовании почвы, винограда и виноградного сока и 1 куб. см ацетона - при исследовании воды, анализируют содержание фенаримола по п. 9.5.

9.3.1. Экстракция

Образец измельченных ягод винограда массой 20 г помещают в коническую колбу вместимостью 250 куб. см, вносят 75 куб. см ацетонитрила, гомогенизируют в течение 3-х минут, затем помещают на встряхиватель на 30 мин. Экстракт фильтруют через складчатый бумажный фильтр в мерный цилиндр вместимостью 100 куб. см с пришлифованной пробкой. Осадок на фильтре промывают 25 куб. см ацетонитрила, промывку также фильтруют в мерный цилиндр, объединяя с экстрактом. Содержимое цилиндра перемешивают, измеряют его объем; 1/2 часть раствора (соответствующую 10 г анализируемого образца) переносят в делительную воронку вместимостью 250 куб. см и подвергают очистке по п. 9.3.2.

9.3.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей

К экстракту в делительной воронке добавляют 30 куб. см гексана, интенсивно встряхивают ее в течение 2-х мин. После полного разделения фаз нижний ацетонитрильный слой отделяют, перенося в мерный цилиндр вместимостью 100 куб. см с пришлифованной пробкой. К оставшемуся в делительной воронке верхнему гексановому слою добавляют 20 куб. см ацетонитрила, интенсивно встряхивают в течение 2-х мин. Нижний ацетонитрильный слой объединяют с первым экстрактом в мерном цилиндре. Гексановый слой отбрасывают. Содержимое цилиндра перемешивают, измеряют его объем; 1/5 его часть (соответствующую 2 г анализируемого образца) переносят в новую делительную воронку вместимостью 250 куб. см; добавляют в нее 50 куб. см 5%-ного раствора хлористого натрия, перемешивают. Вносят в делительную воронку 30 куб. см хлористого метилена, интенсивно ее встряхивают в течение 2-х мин. После полного разделения фаз нижний органический слой отделяют, фильтруют через слой безводного сульфата натрия, помещенный на бумажном фильтре в конусной воронке, в круглодонную колбу вместимостью 150 куб. см. Операцию экстракции повторяют еще дважды, используя по 20 куб. см хлористого метилена. Объединенную органическую фазу, пропущенную через слой сульфата натрия, упаривают досуха и подвергают дополнительной очистке на колонке по п. 9.2.3.

9.4.1. Экстракция

К образцу сока массой 20 г в конической колбе вместимостью 250 куб. см добавляют 75 куб. см ацетонитрила, помещают в холодильник (4 °С) на 1 час. Затем раствор переносят в мерный цилиндр вместимостью 100 куб. см, измеряют объем верхней органической фазы, 1/2 ее часть с помощью пипетки переносят в делительную воронку, добавляют 50 куб. см 5%-ного раствора хлористого натрия, перемешивают. Вносят в делительную воронку 30 куб. см хлористого метилена, интенсивно встряхивают в течение 2-х мин. После полного разделения фаз нижний органический слой отделяют, фильтруют через слой безводного сульфата натрия, помещенный на бумажном фильтре в конусной воронке, в мерный цилиндр вместимостью 100 куб. см. Операцию экстракции повторяют еще дважды, используя по 20 куб. см хлористого метилена. Органическую фазу, пропущенную через слой сульфата натрия, объединяют в мерном цилиндре, перемешивают, измеряют объем раствора, 1/5 его часть (соответствующую 2 г сока) упаривают досуха и подвергают дополнительной очистке на колонке по п. 9.2.3.

Измерения выполняют при следующих режимных параметрах:

Газовый хроматограф "Кристалл-2000М", снабженный детектором электронного захвата ионов

Колонка капиллярная НР-50 длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм, толщина пленки сорбента 0,25 мкм

Температура термостата колонки программированная. Начальная температура - 250 °С, нагрев колонки со скоростью 14 градусов в минуту до температуры 300 °С, выдержка - 10 минут.

Скорость газа 1 (азот): 40 см/сек., давление 191,53 кПа, поток 2,2171 куб. см/мин.

Газ 2: деление потока 1:3,608; сброс 8 куб. см/мин.

Хроматографируемый объем: 1 куб. мм

Ориентировочное время выхода фенаримола: 5 мин. 30 сек.

Образцы, дающие пики большие, чем градуировочный раствор фенаримола с концентрацией 0,2 мкг/куб. см, разбавляют ацетоном.

Содержание фенаримола в пробе сопоставительно оценивают по площади (высоте) хроматографического пика градуировочного раствора аналитического стандарта (введенного в испаритель непосредственно после хроматографирования исследуемого образца).

Содержание фенаримола в пробе (Х, мг/кг, куб. дм) рассчитывают по формуле:

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6.2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана (ФНЦГ им. Ф.Ф. Эрисмана).