"МУК 4.1.2076-06. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методические указания по определению остаточных количеств глюфосинат аммония и его метаболита в зерне гороха газохроматографическим методом"
(утв. Роспотребнадзором 30.07.2006)

1. Методические указания подготовлены Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана при участии специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко.

4. Введены впервые.

Настоящие Методические указания устанавливают метод газожидкостной хроматографии для определения массовой концентрации глюфосинат аммония и его метаболита 3-метилфосфино-пропионовой кислоты в зерне гороха в диапазоне 0,2 - 2,0 мг/кг.

Глюфосинат аммоний - действующее вещество десиканта Баста, ВР (150 г/л), фирма-производитель Байер КропСайенс (Германия).

Аммоний DL-гомоаланин-4-ил-(метил)-фосфинат (I) (ИЮПАК).

Глюфосинат аммоний не обладает тератогенным, канцерогенным и мутагенным действием. Он нетоксичен для водорослей, дафний, дождевых червей, пчел, птиц и диких животных.

Гигиенические нормативы для глюфосинат аммония в России: ОДК в почве - 0,1 мг/кг; ОДУ в воде - 0,01 мг/куб. дм; ОБУВ в воздухе рабочей зоны - 0,04 мг/куб. м; МДУ для плодовых, ягодных и цитрусовых культур, винограда, моркови и картофеля - 0,2 мг/кг, для подсолнечника, гречихи, проса, рапса, льна, зернобобовых, хлебных злаков и растительных масел - 0,4 мг/кг.

Область применения препарата

Глюфосинат аммоний (I) - неселективный контактный гербицид с ограниченной системностью, передвигающийся только внутри обработанных листьев. В процессе поступления в растение вещество диссоциирует и в клетках присутствует только глюфосинат свободная кислота (II). Гербицид используется для уничтожения однолетних и многолетних широколистных и злаковых сорняков в парах, посадках плодовых и цитрусовых культур, ягодных кустарниках и виноградниках путем направленного опрыскивания в период активного роста сорных растений, а также на овощных культурах при довсходовом применении препарата. Глюфосинат аммоний применяется также для десикации ботвы картофеля, подсолнечника, клещевины, люцерны и сеникации яровой пшеницы.

Проходит перерегистрацию в России и странах СНГ под торговым названием Баста, ВР (150 г/л), в качестве десиканта на посевах гороха при норме расхода препарата до 2,0 л/га и однократной обработке в фазе побурения 70 - 75% бобов 5 - 6 нижних ярусов.

Глюфосинат аммоний в воде и растениях подвергается разрушению, в результате чего образуется 3-метилфосфино-пропионовая кислота (III).

Глюфосинат свободная кислота

DL - гомоаланин-4-ил-(метил)-фосфиновая кислота (II) (ИЮПАК).

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в таблице 2.

Методика основана на определении веществ с помощью газожидкостной хроматографии (ГЖХ) с термоионным детектором (ТИД) на фосфорсодержащие вещества. Контроль глюфосинат аммония и его метаболита 3-метилфосфино-пропионовой кислоты в образцах зерна гороха осуществляется по содержанию веществ после экстракции их из анализируемого образца водой и очистки экстрактов на анионообменной смоле Дауэкс 1 х 8, дериватизации веществ с помощью триметилортоацетата в кислой среде и последующей очистки полученных производных на колонках с силикагелем и оксидом алюминия. В результате дериватизации глюфосинат аммоний превращается в метил-4-(метоксиметил)фосфинил-2-ацетамидобутират (IV), а метаболит - в метил-3-(метоксиметил)фосфинилпропионат (V).

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичной или более высокой квалификацией.

Допускается применение другого оборудования с аналогичными или лучшими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя с опытом работы на газовом хроматографе.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией "лаборант", имеющего опыт работы в химической лаборатории.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 + 5) °С и относительной влажности не более 80%.

- выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление растворов и анионообменной смолы, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики, подготовка колонок с анионообменной смолой и силикагелем.

7.1.1. Очистка н-гексана

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до прекращения окрашивания последней в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над поташом.

7.1.2. Очистка метилацетата

Метилацетат промывают последовательно 5%-ным водным раствором карбоната натрия, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над безводным карбонатом калия, перегоняют.

7.1.3. Очистка силикагеля

Силикагель встряхивают с двойным объемом очищенного ацетона и затем фильтруют на воронке Бюхнера через бумажный фильтр. Силикагель на фильтре промывают 1,5 объемом ацетона и затем высушивают при температуре 130 °С в течение 5 часов.

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 200 - 300 куб. см деионизованной воды, добавляют 100 куб. см 98%-ной муравьиной кислоты, перемешивают, доводят водой до метки, тщательно перемешивают.

40 г NaOH переносят в мерную колбу вместимостью 1000 куб. см, добавляют 500 - 600 куб. см деионизованной воды, перемешивают до полного растворения осадка, охлаждают раствор до комнатной температуры, доводят водой до метки, вновь перемешивают.

В химический стакан вместимостью 2000 куб. см помещают 100 г анионообменной смолы Дауэкс 1 х 8 (СГ-форма), приливают 1000 куб. см 1 М раствора гидроксида натрия и суспензию перемешивают в течение 2-х мин. Через 30 мин. суспензию фильтруют на воронке Бюхнера через бумажный фильтр. Смолу на фильтре промывают деионизованной водой до тех пор, пока рН фильтрата не снизится до 5,5 - 7. Обычно для приготовления 100 г смолы расходуют 3 - 5 куб. дм деионизованной воды.

В нижнюю часть стеклянной колонки (1,2 х 25 см) помещают тампон из стекловаты и в колонку (при открытом кране) медленно выливают суспензию смолы в воде таким образом, чтобы высота сорбента составила 12 см. Колонку промывают 30 куб. см деионизованной воды со скоростью 1 - 2 капли в секунду, после чего она готова к работе.

Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см, внутренним диаметром 10 - 12 мм уплотняют тампоном из стекловаты, медленно выливают в колонку (при открытом кране) суспензию 10 г оксида алюминия I степени активности в 15 куб. см метилацетата. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку промывают 15 куб. см метилацетата со скоростью 1 - 2 капли в сек. После этого колонка готова к работе.

В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 10 - 12 мм помещают тампон из стекловаты и в колонку (при открытом кране) медленно выливают суспензию 5 г силикагеля I степени активности в 10 куб. см метилацетата. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку промывают 10 куб. см метилацетата со скоростью 1 - 2 капли в сек., после чего она готова к работе.

В круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см помещают по 0,5 куб. см градуировочных растворов N 1 дериватов глюфосинат аммония и метаболита с концентрацией 10 мкг/куб. см в метилацетате (п. 7.10.2), раствор упаривают досуха, остаток растворяют в 3 куб. см метилацетата. Раствор наносят на колонку, подготовленную по п. 7.7. Промывают колонку 30 куб. см смеси метилацетат - метанол (95:5, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в сек., элюат отбрасывают. Затем колонку последовательно промывают 30 куб. см смеси метилацетат - метанол (9:1, по объему) и 40 куб. см смеси метилацетат - метанол (8:2, по объему). Фракционно (по 10 куб. см) отбирают элюат, упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре 40 °С до объема 0,5 - 1 куб. см. Раствор переносят в градуированную пробирку вместимостью 5 куб. см, колбу промывают 1 куб. см метилацетата, который также переносят в пробирку. Доводят метилацетатом объем в пробирке до 4 куб. см и анализируют на содержание дериватов по п. 9.5. Первые три фракции, содержащие дериват метаболита, анализируют по п. 9.6.2, а последующие четыре, содержащие дериват глюфосинат аммония, по п. 9.6.1.

Примечание. При использовании новой партии сорбента или растворителей проводится проверка хроматографического поведения дериватов глюфосинат аммония и его метаболита на колонке.

Готовую насадку (3% FFAP на Хромосорбе W/HP) засыпают в стеклянную колонку, уплотняют под вакуумом, колонку устанавливают в термостат хроматографа, не подсоединяя к детектору, и стабилизируют в токе азота при температуре 250 °С в течение 8 - 10 часов.

7.10.1. Исходные растворы дериватов глюфосинат аммония и его метаболита (3-метилфосфино-пропионовая кислота) для градуировки (концентрация 1 мг/куб. см в пересчете на эквивалент глюфосинат свободной кислоты). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 139 мг метил-4-(метоксиметил)фосфинил-2-ацетамидобутирата (IV, дериват глюфосинат аммония) или 100 мг метил-3-(метоксиметил)фосфинилпропионата (V, дериват метаболита), растворяют в 40 - 50 куб. см метанола, доводят метанолом до метки, тщательно перемешивают.

Растворы хранят в морозильной камере при температуре не выше -18 °С в течение 3-х месяцев.

7.10.2. Растворы дериватов глюфосинат аммония и его метаболита N 1 для градуировки (концентрация 10 мкг/куб. см в пересчете на эквивалент глюфосинат свободной кислоты). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 1 куб. см исходного раствора деривата глюфосинат аммония (или деривата метаболита) с концентрацией 1 мг/куб. см (п. 7.10.1), разбавляют метилацетатом до метки.

Градуировочные растворы N 1 хранят в морозильной камере при температуре не выше -18 °С в течение месяца.

7.10.3. Рабочие растворы N 2 - 5 дериватов глюфосинат аммония и его метаболита для градуировки (концентрация 0,1 - 1,0 мкг/куб. см в пересчете на эквивалент глюфосинат свободная кислота). В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают по 1,0, 2,0, 5,0 и 10,0 куб. см градуировочного раствора N 1 деривата глюфосинат аммония (или деривата метаболита) с концентрацией 10 мкг/куб. см (п. 7.10.2), доводят до метки метилацетатом, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 2 - 5 с концентрацией глюфосинат аммония (или метаболита) 0,1, 0,2, 0,5 и 1,0 мкг/куб. см, соответственно.

Растворы готовят непосредственно перед употреблением.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (мВ х сек.) от концентрации глюфосинат аммония (или его метаболита) в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4-м растворам для градуировки.

Отвешивают 109 мг глюфосинат аммония в мерную колбу вместимостью 100 мл, добавляют 60 - 70 куб. см 0,015 М раствора водного аммиака, перемешивают до полного растворения вещества и доводят объем этим же растворителем до метки. Концентрация глюфосинат аммония в растворе (A) составляет 1 мг/куб. см в пересчете на эквивалент глюфосинат свободная кислота. Раствор A хранят в холодильнике не более месяца.

Отвешивают 84 мг 3-метилфосфино-пропионовой кислоты в мерную колбу вместимостью 100 куб. см, добавляют 60 - 70 куб. см 0,015 М раствора водного аммиака, перемешивают до полного растворения вещества и доводят объем этим же растворителем до метки. Концентрация метаболита в растворе (B) составляет 1 мг/куб. см в пересчете на эквивалент глюфосинат свободная кислота. Раствор B хранят в холодильнике не более месяца.

Переносят в мерную колбу вместимостью 100 куб. см по 1 куб. см растворов A и B и доливают 0,015 М раствор водного аммиака до метки, перемешивают. Концентрация глюфосинат аммония и его метаболита в растворе (C) составляет 10 мкг/куб. см в пересчете на эквивалент глюфосинат свободная кислота. Раствор хранят в холодильнике не более месяца.

Раствор C используют для приготовления проб зерна гороха с внесением при оценке полноты извлечения глюфосинат аммония и его метаболита из исследуемых образцов.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79) и правилами, определенными ГОСТом 10852-86 "Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб". Отобранные пробы зерна гороха досушивают до стандартной влажности и хранят в матерчатых или бумажных мешочках при температуре 4 °С. Перед анализом семена измельчают на кофемолке.

Навеску (10 г) измельченного материала помещают в коническую колбу вместимостью 250 куб. см, добавляют 100 куб. см деионизованной воды и суспензию перемешивают в течение 30 минут на аппарате для встряхивания. Суспензию фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр. Остаток на фильтре промывают 50 куб. см деионизованной воды. Объединенный фильтрат переносят в мерный цилиндр вместимостью 250 куб. см и доводят деионизованной водой до объема 200 куб. см. Отбирают аликвоту раствора (100 мл), эквивалентную 5 г растительного материала, в центрифужные пробирки и центрифугируют при 10000 g в течение 15 минут. Надосадочную жидкость используют для дальнейшей очистки по п. 9.2.

Аликвоту водного экстракта (из п. 9.1) вносят в подготовленную колонку с анионообменной смолой (п. 7.5) и раствор пропускают со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Промывают колонку 50 куб. см деионизованной воды и затем элюируют глюфосинат аммоний и его метаболит 80 куб. см 10%-ной муравьиной кислоты с указанной выше скоростью. Элюат упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре 55 °С в грушевидной колбе вместимостью 250 куб. см. К остатку приливают 10 куб. см деионизованной воды и раствор упаривают досуха.

К сухому остатку (из п. 9.2) приливают 3 куб. см ледяной уксусной кислоты, перемешивают и колбу помещают в ультразвуковую ванну на 1 мин. Затем в колбу добавляют 12 куб. см триметилортоацетата и несколько стеклянных кипелок и снова помещают в ультразвуковую ванну на 1 мин. Реакционную смесь кипятят с обратным холодильником в течение 4,5 часов на электроплитке. К охлажденной реакционной смеси трижды добавляют по 15 куб. см толуола и каждый раз упаривают содержимое на ротационном вакуумном испарителе при температуре 40 °С до объема 1 - 2 куб. см. Дальнейшую очистку дериватов проводят по пп. 9.4 и 9.5.

Примечание: При проведении дериватизации посуда и реактивы должны быть сухими.

К раствору дериватов глюфосинат аммония и метаболита в круглодонной колбе, полученного по п. 9.3, добавляют 2 куб. см метилацетата и раствор переносят на колонку с оксидом алюминия, подготовленную п. 7.6. Колбу обмывают дважды порциями по 2 куб. см метилацетата, которые также наносят на колонку. Промывают колонку 30 куб. см метилацетата со скоростью 1 - 2 капли в сек., элюат отбрасывают. Дериваты глюфосинат аммония и метаболита элюируют с колонки 50 куб. см смеси метилацетат - метанол (9:1, по объему), собирая элюат непосредственно в круглодонную колбу. Раствор упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °С до объема 0,5 - 1 куб. см.

К раствору дериватов глюфосинат аммония и метаболита в круглодонной колбе, полученного по п. 9.4, добавляют 2 куб. см смеси метилацетат - метанол (95:5, по объему) и раствор переносят на колонку с силикагелем, подготовленную по п. 7.7. Колбу обмывают дважды порциями по 2 куб. см смеси метилацетат - метанол (95:5, по объему), которые также наносят на колонку. Промывают колонку 30 куб. см смеси метилацетат - метанол (95:5, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в сек., элюат отбрасывают. Дериваты метаболита и глюфосинат аммония элюируют с колонки последовательно соответственно 30 куб. см смеси метилацетат - метанол (9:1, по объему) и 40 куб. см смеси метилацетат - метанол (8:2, по объему), собирая элюаты непосредственно в круглодонные колбы вместимостью 100 куб. см. Растворы упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре 40 °С до объема 0,5 - 1 куб. см. Растворы переносят в градуированные пробирки вместимостью 10 куб. см, колбы обмывают трижды порциями по 2 куб. см метилацетата, которые также переносят в пробирки. Доводят метилацетатом объем в пробирках до 10 куб. см и анализируют на содержание дериватов глюфосинат аммония и метаболита по пп. 9.6.1 и 9.6.2.

9.6.1. Анализ глюфосинат аммония

Колонка стеклянная спиральная 1000 х 3 мм; неподвижная фаза 3% FFAP на Хромосорбе W/HP (0,12 - 0,15 мм)

Температура колонки - 230 °С, инжектора - 230 °С, детектора 300 °С

Скорость потока газа-носителя (азот) - 30 мл/мин.

Расход водорода - 12,5 мл/мин.

Расход воздуха - 200 мл/мин.

Объем вводимой пробы - 2 мкл

Время удерживания метил-4-(метоксиметил)фосфинил-2-ацетамидобутирата: 2 мин. 50 сек.

Линейный диапазон детектирования - 0,2 - 2 нг

Каждую анализируемую пробу вводят в хроматограф 3 раза и вычисляют среднюю площадь пика.

Образцы, дающие пики большие чем стандартный раствор с концентрацией 1,0 мкг/куб. см, разбавляют метилацетатом.

9.6.2. Анализ 3-метилфосфино-пропионовой кислоты

Колонка стеклянная, спиральная 1000 х 3 мм; неподвижная фаза 3% FFAP на Хромосорбе W/HP (0,12 - 0,15 мм)

Температура колонки - 178 °С, инжектора - 230 °С, детектора 300 °С

Скорость потока газа-носителя (азот) - 30 мл/мин.

Расход водорода - 12,5 мл/мин.

Расход воздуха - 200 мл/мин.

Объем вводимой пробы - 2 мкл

Время удерживания метил-3-(метоксиметил)фосфинилпропионата: 2 мин. 10 сек.

Линейный диапазон детектирования - 0,2 - 2 нг

Каждую анализируемую пробу вводят в хроматограф 3 раза и вычисляют среднюю площадь пика.

Образцы, дающие пики большие чем стандартный раствор с концентрацией 1,0 мкг/куб. см, разбавляют метилацетатом.

Содержание глюфосинат аммония (в пересчете на эквивалент глюфосинат свободная кислота) рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:

Содержание 3-метилфосфино-пропионовой кислоты (в пересчете на эквивалент глюфосинат свободная кислота) рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе "менее нижней границы определения"

менее 0,2 мг/кг <*>.

--------------------------------

<*> 0,2 мг/кг - предел обнаружения глюфосинат аммония и метаболита.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

ВНИИ фитопатологии, 143050, Московская обл., п/о Большие Вяземы, тел. 592-92-20.