"МУК 4.1.2001-05. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методические указания по определению остаточных количеств квизалофоп-П-тефурила по основному метаболиту квизалофопу-П в семенах рапса и растительных маслах (рапса, сои, подсолнечника) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии"
(утв. Роспотребнадзором 22.07.2005)

1. Методические указания подготовлены Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана; Всероссийским институтом защиты растений при участии специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, (протокол N 2 от 16.06.2005).

3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко.

4. Введены впервые.

Настоящие Методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения в семенах рапса и растительных маслах (рапса, сои, подсолнечника) массовых концентраций квизалофоп-П-тефурила по метаболиту квизалофопу-П в диапазоне 0,02 - 0,2 мг/кг.

Квизалофоп-П-тефурил - действующее вещество препарата ПАНТЕРА, КЭ (40 г/л), фирма-производитель "Кромптон" (Англия).

(R)-2-[4-(6=хлорхиноксалин-2-илокси)фенокси]пропионовой кислоты тетрагидрофурфуриловый эфир (IUPAC).

Структурная формула (не приводится).

Вещество относительно стабильно в кислой среде, период полураспада в почве до 60-ти дней.

Квизалофоп-П является основным биологически активным метаболитом, определяемым в растениях и почве.

Область применения препарата

Квизалофоп-П-тефурил - послевсходовый гербицид для борьбы с однолетними и многолетними злаковыми сорными растениями при возделывании овощных и технических культур.

Гигиенические нормативы: МДУ в картофеле, моркови, томатах, капусте, подсолнечнике (семена), сое (семена), свекле сахарной, кормовой, столовой - 0,04 мг/кг; луке (репка), подсолнечнике (масло), сое (масло) - 0,06 мг/кг.

Метрологические характеристики метода представлены в таблицах 1 и 2.

Методика основана на определении вещества с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовым детектором (УФ) после экстракции из анализируемой пробы семян смесью ацетонитрил - вода - уксусная кислота, масла - ацетонитрилом, очистки экстракта перераспределением между двумя несмешивающимися фазами и на колонке с кизельгелем.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

Нижний предел измерения в хроматографируемом объеме пробы - 2 нг.

В предлагаемых условиях определения метод специфичен в присутствии пестицидов, применяемых в технологии выращивания рапса, подсолнечника, сои.

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичной или более высокой квалификацией.

Допускается применение хроматографических колонок и другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостной хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на жидкостном хроматографе.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией "лаборант", имеющего опыт работы в химической лаборатории.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °С и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление растворов, установление градуировочной характеристики, подготовка колонки с кизельгелем для очистки экстракта, проверка хроматографического поведения вещества на колонке.

7.1. Подготовка органических растворителей

7.1.1. Очистка ацетонитрила

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора не менее 1 часа, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия.

7.1.2. Очистка этилацетата

Этилацетат промывают последовательно 5%-ным водным раствором карбоната натрия, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над безводным карбонатом калия и перегоняют или подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретических тарелок не менее 50.

7.1.3. Очистка н-гексана и хлористого метилена

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до тех пор, пока она не перестанет окрашиваться в желтый цвет, водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над поташом.

7.2. Приготовление смеси растворителей для экстракции

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 900 куб. см ацетонитрила, 100 куб. см дистиллированной воды и 1 куб. см уксусной кислоты, тщательно перемешивают.

7.3. Приготовление 0,2% раствора уксусной кислоты в этилацетате

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 600 - 700 куб. см этилацетата, вносят 2 куб. см уксусной кислоты, тщательно перемешивают.

7.4. Приготовление 0,2 н раствора гидроксида калия

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 11,2 г гидроксида калия, растворяют в 600 - 700 куб. см деионизованной воды, доводят водой до метки, тщательно перемешивают.

7.5. Приготовление 6 н раствора серной кислоты

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 400 - 500 куб. см деионизованной воды, вносят 336 куб. см концентрированной серной кислоты, перемешивают, доводят водой до метки, вновь перемешивают.

7.6. Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают куб. 550 см ацетонитрила, 450 куб. см деионизированной воды, 1 куб. см орто-фосфорной кислоты, перемешивают, фильтруют и дегазируют.

7.7. Кондиционирование хроматографической колонки

Промывают колонку подвижной фазой (приготовленной по п. 7.6) при скорости подачи растворителя 1,0 куб. см/мин. до установления стабильной базовой линии.

7.8. Приготовление градуировочных растворов

7.8.1. Исходный раствор квизалофопа-П для градуировки (концентрация 500 мкг/куб. см).

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 0,01 г квизалофопа-П, растворяют в 50 - 70 куб. см метанола, доводят метанолом до метки, тщательно перемешивают. Раствор хранится в холодильнике в течение 3-х месяцев.

Растворы N 1 - 5 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходного раствора.

7.8.2. Раствор N 1 квизалофопа-П для градуировки (концентрация 10 мкг/куб. см).

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 2,0 куб. см исходного раствора с концентрацией 100 мкг/куб. см (п. 7.8.1), доводят до метки подвижной фазой (приготовленной по п. 7.6), тщательно перемешивают.

Раствор хранится в холодильнике в течение месяца.

7.8.3. Рабочие растворы N 2 - 5 квизалофопа-П для градуировки (концентрация 0,1 - 1,0 мкг/куб. см).

В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают по 1,0; 2,0; 5,0 и 10,0 куб. см раствора N 1 с концентрацией 10 мкг/куб. см (п. 7.8.2), доводят до метки подвижной фазой, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 2 - 5 с концентрацией квизалофопа-П 0,1; 0,2; 0,5 и 1,0 мкг/куб. см соответственно. Растворы хранятся в холодильнике не более недели.

7.9. Приготовление растворов внесения для оценки полноты извлечения квизалофопа-П из исследуемых образцов

7.9.1. Исходный раствор квизалофопа-П (концентрация 100 мкг/куб. см).

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 0,01 г квизалофопа-П, растворяют в 50 - 70 куб. см изопропилового спирта, доводят им же до метки, тщательно перемешивают.

7.9.2. Основной раствор квизалофопа-П для внесения (концентрация 10 мкг/куб. см).

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 10,0 куб. см исходного раствора с концентрацией 100 мкг/куб. см (п. 7.9.1), доводят до метки изопропанолом, тщательно перемешивают.

Раствор хранится в холодильнике не более 2-х недель.

7.10. Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади (высоты) пика от концентрации квизалофопа-П в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4-м растворам для градуировки N 2 - 5.

В испаритель хроматографа вводят по 1 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.3. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений.

7.11. Подготовка колонки с кизельгелем для очистки экстракта

Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см, внутренним диаметром 8 - 10 мм уплотняют тампоном из стекловаты, медленно выливают в колонку (при открытом кране) суспензию 5 г кизельгеля в 15 - 20 куб. см гексана. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1,5 см. После этого колонка готова к работе.

7.12. Проверка хроматографического поведения квизалофопа-П на колонке с кизельгелем

В круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см помешают 0,5 куб. см основного раствора квизалофопа-П для внесения с концентрацией квизалофопа-П 10 мкг/куб. см (п. 7.9.2), растворитель упаривают досуха, добавляют 1 куб. см этилацетата, помещают на ультразвуковую баню на 1 мин., вносят 4 куб. см гексана, перемешивают, вновь помещают на ультразвуковую баню на 1 мин. и наносят на колонку, подготовленную по п. 7.11. Промывают колонку последовательно 30 куб. см гексана, 25 куб. см смеси гексан - этилацетат (8:2, по объему), затем 25 куб. см смеси гексан - этилацетат (1:1, по объему) и 30 куб. см этилацетата, элюат отбрасывают.

Затем колонку промывают 70 куб. см 2%-ным раствором уксусной кислоты в этилацетате (п. 7.3) со скоростью 1 - 2 капли в сек. Фракционно (по 10 куб. см) отбирают элюат, упаривают, остатки растворяют в 1 куб. см подвижной фазы, анализируют содержание квизалофопа-П по п. 9.3.

Фракции, содержащие квизалофоп-П, объединяют и вновь анализируют.

Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с колонки и необходимый для очистки объем элюента.

Примечание: Проверку хроматографического поведения квизалофопа-П следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии сорбентов и растворителей.

Отбор проб производится в соответствии с правилами, определенными ГОСТ 10852-86.

Отобранные пробы семян рапса хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике не более 10-ти дней. Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре -18 °С.

Пробы масла (помещенные в стеклянные флаконы) хранят в холодильнике в течение месяца.

Перед анализом образцы семян измельчают.

9.1.1. Экстракция

Образец измельченных семян массой 20 г помещают в коническую колбу вместимостью 400 куб. см, вносят 100 куб. см смеси ацетонитрил - вода - уксусная кислота (90:10:1, по объему) и помещают на встряхиватель на 1 час.

Раствор фильтруют на воронке Бюхнера через двойной бумажный фильтр "красная лента" под вакуумом. Осадок на фильтре трижды промывают смесью ацетонитрил - вода - уксусная кислота (90:10:1, по объему) порциями по 40 и 30 куб. см (дважды). Экстракт и промывки переносят в мерный цилиндр вместимостью 200 - 250 куб. см с пришлифованной пробкой, перемешивают. Далее половину раствора (соответствующую массе анализируемого образца 10 г) переносят в делительную воронку вместимостью 500 куб. см и проводят очистку экстракта по п. 9.1.2.

9.1.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей

К экстракту, полученному по п. 9.1.1, помещенному в делительную воронку вместимостью 500 куб. см, добавляют 0,1 н раствора гидроксида калия, перемешивают и оставляют на 30 мин. Затем в делительную воронку вносят 50 куб. см гексана, интенсивно ее встряхивают в течение 2-х мин. После полного разделения фаз верхний органический слой отделяют и отбрасывают. Операцию промывки щелочного раствора повторяют еще дважды, используя по 30 куб. см гексана.

Далее раствор в делительной воронке подкисляют с помощью 6 н раствора серной кислоты до pH 3 (контролируя его значение по универсальной индикаторной бумаге). Вносят в воронку 50 куб. см хлористого метилена, интенсивно встряхивают делительную воронку в течение 2-х мин. После полного разделения фаз нижний органическим слой отделяют, фильтруют через слой безводного сульфата натрия, помещенный на бумажном фильтре в конусной воронке, в круглодонную колбу вместимостью 250 куб. см.

Операцию экстракции водной фазы повторяют еще дважды, используя по 40 куб. см хлористого метилена. Объединенную органическую фазу, пропущенную через слой сульфата натрия, упаривают досуха и подвергают дополнительной очистке на колонке по п. 9.1.3.

9.1.3. Очистка экстракта на колонке с кизельгелем

Остаток, полученный по п. 9.1.2, находящийся в круглодонной колбе, растворяют в 2-х куб. см этилацетата, помещая на ультразвуковую баню на 1 мин., добавляют 8 куб. см гексана, перемешивают, вновь помещают на ультразвуковую баню на 1 мин. Затем раствор наносят на колонку, подготовленную по п. 7.11. Колбу обмывают трижды порциями гексана по 3 куб. см, которые также наносят на колонку. Промывают колонку последовательно 30 куб. см гексана, 25 куб. см смеси гексан - этилацетат (8:2, по объему), 25 куб. см смеси гексан - этилацетат (1:1, по объему) и 30 куб. см этилацетата, элюат отбрасывают.

Квизалофоп-П элюируют с колонки 50 куб. см 0,2%-ной уксусной кислоты в этилацетате со скоростью 1 - 2 капли в сек., собирая элюат в круглодонную колбу. Раствор упаривают досуха при температуре не выше 35 °С, остаток в колбе растворяют в 2-х куб. см подвижной фазы и анализируют содержание квизалофопа-П по п. 9.3.

9.2.1. Экстракция

Образец масла массой 10 г помешают в коническую колбу вместимостью 200 - 250 куб. см, вносят 50 куб. см ацетонитрила и помещают на магнитную мешалку на 15 мин. После полного разделения фаз верхний ацетонитрильный слой осторожно декантируют через бумажный фильтр, помещенный в конусную воронку, в круглодонную колбу вместимостью 150 - 200 куб. см. Экстракцию повторяют еще дважды порциями ацетонитрила по 30 куб. см. Объединенный отфильтрованный экстракт, помещенный в круглодонную колбу, упаривают досуха при температуре не выше 35 °С и подвергают очистке по п. 9.2.2.

9.2.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей

Объединенный отфильтрованный экстракт переносят в делительную воронку вместимостью 250 куб. см, добавляют 50 куб. см гексана, интенсивно встряхивают делительную воронку в течение 2-х мин. После полного разделения фаз нижний ацетонитрильный слой отделяют, перенося в коническую колбу. Верхний гексановый слой отбрасывают. Ацетонитрильную фазу вновь переносят в делительную воронку и повторяют операцию промывки еще дважды, используя по 30 куб. см гексана. Ацетонитрильный раствор переносят в круглодонную колбу вместимостью 250 куб. см и подвергают очистке на колонке с кизельгелем по п. 9.1.3.

Измерения выполняют при следующих режимных параметрах:

Колонка стальная длиной 25 см, внутренним диаметром 4,0 мм, содержащая Кромасил 100 С 18 зернением 8 мкм

Температура колонки: комнатная

Подвижная фаза: ацетонитрил - вода - орто-фосфорная кислота (550:450:1, по объему)

Скорость потока элюента: 1,0 куб. см/мин

Рабочая длина волны: 240 нм

Чувствительность: 0,02 ед. абсорбции на шкалу

Объем вводимой пробы: 20 куб. мм

Ориентировочное время выхода квизалофопа-П: 9,5 - 9,8 мин

Образцы, дающие пики большие, чем градуировочный раствор квизалофопа-П с концентрацией 1 мкг/куб. см, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ (подготовленной по п. 7.7).

Содержание квизалофоп-П-тефурила в пробе (Х, мг/кг) по основному метаболиту квизалофопу-П рассчитывают по формуле:

где:

А - концентрация квизалофопа-П, найденная по градуировочному графику, мкг/куб. см;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;

m - масса анализируемого образца, г;

К - коэффициент пересчета содержания квизалофопа-П на квизалофоп-П-тефурил, равный 1,24 (по соотношению молекулярных масс).

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".