"МУК 4.1.1959-05. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Спектрофотометрическое определение субтилизина (протеазы) в атмосферном воздухе. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 21.04.2005)

1. Разработаны ГУ НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина РАМН (к.х.н. А.А. Беззубовым) и НИЦ "ЭКОС" (В.А. Смирновым).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 21 апреля 2005 г.

3. Введены в действие с 1 июля 2005 г.

4. Введены впервые.

Настоящие Методические указания устанавливают количественный спектрофотометрический анализ атмосферного воздуха для определения в нем субтилизина (протеазы) в диапазоне концентраций 0,005 - 0,05 мг/куб. м.

Методические указания предназначены для использования лабораториями центров гигиены и эпидемиологии при осуществлении аналитического контроля химического загрязнения атмосферного воздуха в районе расположения производства субтилизина (протеазы), производственными лабораториями предприятий, научно-исследовательскими институтами, работающими в области гигиены окружающей среды.

Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ Р 8.563-96 "Методика выполнения измерений", ГОСТ 17.2.4.02-81 "Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ".

Методические указания одобрены и рекомендованы к практическому применению на бюро секции по физико-химическим методам исследования объектов окружающей среды Проблемной комиссии "Научные основы экологии человека и гигиены окружающей среды" и бюро Комиссии по государственному санитарно-эпидемиологическом нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Субтилизин (протеаза) является ферментом класса гидролаз и катализирует гидролиз белков и пептидов, а также сложных эфиров и амидов N-защищенных аминокислот. Продуцируется Bacillus subtilis и родственными бактериями. Молекулярная масса более 27000. Выпускается в виде гранул кремового цвета со слабым запахом. Растворим в воде и растворах щелочей. Применяется в химической промышленности, в частности, как добавка к синтетическим моющим средствам.

Субтилизин (протеаза) обладает раздражающим действием на кожу и слизистые оболочки глаз, является аллергеном. В атмосферном воздухе находится в виде аэрозоля. ОБУВ протеазы щелочной - 0,01 мг/куб. м.

Методика обеспечивает выполнение измерений с погрешностью, не превышающей +/- 21%. При доверительной вероятности 0,95.

Измерение концентраций субтилизина (протеазы) основано на улавливании его из воздуха и концентрировании на фильтре с последующей десорбцией 2 Н раствором гидрооксида натрия, реакции образования окрашенного комплекса с солью меди (метод Лоури) и последующем спектрофотометрировании при длине волны 650 нм.

Нижний предел измерения содержания субтилизина (протеазы) в анализируемом объеме пробы - 10 мкг.

Измерению мешают фенол, тимол, сульфосалицил, а также белки.

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, материалы и реактивы.

6.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работы с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.005-88.

6.2. При выполнении измерений концентраций субтилизина (протеазы) с использованием спектрофотометра СФ-46 и электроаспиратора следует соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкциями по эксплуатации приборов.

К выполнению измерений и обработке их результатов на спектрофотометре и электроаспираторе допускаются лица, знающие устройство и правила эксплуатации приборов.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

8.1. Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 +/- 5) °С, атмосферном давлении 630 - 800 мм рт. ст. и влажности воздуха не более 80%.

8.2. Выполнение измерений на спектрофотометре СФ-46 проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору и настоящими Методическими указаниями.

Перед выполнением измерений проводят следующие работы: приготовление реактивов, подготовка спектрофотометра к работе, установление градуировочной характеристики, отбор проб.

Исходный раствор протеазы для градуировки (с = 1 мг/куб. см). В мерную колбу емкостью 25 куб. см вносят 26,3 мг (95% основного вещества), доводят 2 Н раствором гидроокиси натрия до метки и тщательно перемешивают. Срок хранения исходного раствора 6 часов.

Рабочий раствор протеазы для градуировки (с = 100 мкг/куб. см). В мерную колбу емкостью 25 куб. см помещают 2,5 куб. см исходного раствора, доводят 2 Н раствором гидрооксида натрия до метки и тщательно перемешивают. Срок хранения рабочего раствора 6 часов.

0,1 Н раствор гидрооксида натрия. В колбу емкостью 1000 куб. см помещают 4,0 г гидрооксида натрия, приливают дистиллированную воду до метки и тщательно перемешивают до полного растворения.

2 Н раствор гидрооксида натрия. В колбу емкостью 1000 куб. см помещают 80,0 г гидроокиси натрия, приливают дистиллированную воду до метки и тщательно перемешивают до полного растворения.

Рабочий раствор N 1. В колбу емкостью 100 куб. см помещают 10,0 г углекислого натрия, 0,2 г калий-натрий тартрата, 0,05 г серно-кислой меди, приливают дистиллированную воду до метки и тщательно перемешивают.

Исходный раствор реактива Фолина. В круглодонную колбу емкостью 1000 куб. см помещают 50,0 г натрия вольфрамово-кислого, 12,5 г натрия молибденово-кислого, добавляют 360 куб. см дистиллированной воды и перемешивают до полного растворения реактивов. К полученному раствору добавляют 25 куб. см 85% раствора ортофосфорной кислоты, 50 куб. см концентрированной соляной кислоты и смесь кипятят в течение 10 ч с обратным холодильником. Затем добавляют 76 г лития серно-кислого, 25 куб. см дистиллированной воды и 3 капли брома. Кипятят под тягой без обратного холодильника для удаления остатка брома. Охлаждают до комнатной температуры и доводят дистиллированной водой до объема 500 куб. см, перемешивают и фильтруют. Из фильтрата отбирают 1 куб. см, добавляют 9 куб. см дистиллированной воды и титруют 0,1 н раствором гидрооксида натрия по фенолфталеину. Реактив Фолина с установленным титром доводят дистиллированной водой до 1 н концентрации. Раствор хранят в темной склянке с притертой пробкой в холодильнике. Срок хранения реактива - 1 месяц.

Рабочий раствор реактива Фолина готовят перед употреблением путем разбавления 1 куб. см исходного раствора реактива Фолина дистиллированной водой до объема 8 куб. см в расчете на одну пробу.

Подготовку спектрофотометра к работе проводят в соответствии с инструкцией по эксплуатации.

Градуировочную характеристику устанавливают на градуировочных растворах. Она выражает зависимость оптической плотности растворов от массы субтилизина (протеазы) и устанавливается по 5 сериям растворов для градуировки.

Каждую серию, состоящую из 6 растворов, готовят в пробирках с притертыми пробками. Для этого в них вносят рабочий раствор протеазы и 2 Н раствор гидрооксида натрия в соответствии с таблицей. После этого в каждую пробирку приливают 2,0 куб. см рабочего раствора N 1, тщательно перемешивают и выдерживают в течение 10 мин. Затем добавляют 8 куб. см рабочего раствора реактива Фолина, перемешивают и нагревают на водяной бане при температуре 50 °С в течение 5 мин. После быстрого охлаждения замеряют оптическую плотность растворов в кювете с толщиной оптического слоя 2,0 мм при длине волны 650 нм по отношению к раствору N 1 в таблице. Строят градуировочную характеристику, нанося на ось ординат значения оптических плотностей градуировочных растворов, а на ось абсцисс - соответствующие им величины содержания протеазы. Градуировку проверяют 1 раз в 3 месяца или в случае использования новой партии реактивов.

Отбор проб воздуха, содержащего субтилизин (протеазу), проводят согласно ГОСТ 17.2.3.01-86. Воздух аспирируют с помощью электроаспиратора через фильтр со скоростью 200 куб. дм/мин. в течение 30 мин. Отобранные пробы помещают в пробирки с притертыми пробками.

Срок хранения - 3 дня.

Фильтр с отобранной пробой помещают в бюкс, заливают 3 куб. см 2 Н раствора гидрооксида натрия и оставляют на 10 - 15 мин., периодически помешивая стеклянной палочкой. Степень десорбции протеазы с фильтра 98%. Фильтр отжимают и отбрасывают. Для анализа отбирают 1,0 куб. см полученного раствора и далее проводят анализ в условиях, описанных в п. 9.3.

Расчет содержания субтилизина (протеазы) проводят по градуировочной характеристике.

Концентрацию субтилизина (протеазы) в атмосферном воздухе (мг/куб. м) вычисляют по формуле:

Результаты измерений концентраций субтилизина (протеазы) оформляют протоколом в виде: С, мг/куб. м; ДЕЛЬТА +/- 21% с указанием даты проведения анализа, места отбора пробы, названия лаборатории, юридического адреса организации, ответственного исполнителя и руководителя лаборатории.

Контроль погрешности измерений содержания субтилизина (протеазы) проводят на градуировочных растворах в соответствии с п. п. 10 и 11. Рассчитывают среднее значение результатов измерения содержания протеазы в градуировочных растворах:

Рассчитывают среднее квадратичное отклонение измерения концентрации:

Рассчитывают доверительный интервал:

Если дельта <= 21%, то погрешность измерений удовлетворительная. Если данное условие не выполняется, то выясняют причину и повторяют измерения.