"МУК 4.1.2058-06. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методические указания по определению остаточных количеств флуазифоп-П-бутила в семенах и масле рапса, подсолнечника, зерне и масле сои, зерне гороха и луке по основному метаболиту флуазифоп-П кислоте методом капиллярной газожидкостной хроматографии"
(утв. Роспотребнадзором 10.04.2006)

1. Методические указания подготовлены Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана при участии специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко.

4. Введены впервые.

Фирма-регистрант: Агрохим XXI.

Торговое наименование препарата: Легионер, КЭ.

Действующее вещество (д.в.): флуазифоп-П-бутил.

Название д.в. по номенклатуре ИЮПАК: бутил(R)-2-[4-[(5-трифторметил-2-пиридилокси) фенокси]пропионат.

Структурная формула (не приводится).

Физиологически активная форма флуазифоп-П-бутила - свободная кислота. Гербицидная активность проявляется в результате образования в обработанных растениях флуазифопа-П. Эфир разрушается до кислоты в растениях в среднем в течение 1 - 2 недель в зависимости от вида растений.

Краткая характеристика флуазифоп-П кислоты:

Название по номенклатуре ИЮПАК: (R)-2-[4-(5-трифлуорометил-2-пиридокси)фенокси]пропионовая кислота.

Структурная формула (не приводится).

Гигиенические нормативы, установленные в России: МДУ в семенах и масле рапса - 0,04 мг/кг, ВМДУ в семенах и масле подсолнечника и сои - 0,04 мг/кг, ВМДУ в зерне гороха - 0,03 мг/кг, МДУ в луке - 0,02 мг/кг.

Область применения: селективный послевсходовый гербицид, эффективен против однолетних и многолетних злаковых сорняков.

2.1.1. Принцип метода

Методика основана на определении флуазифоп-П-бутила и флуазиоп-П кислоты - основного метаболита флуазифоп-П-бутила - методом капиллярной газожидкостной хроматографии с электронозахватным детектором и включает извлечение остаточных количеств флуазифоп-П бутила и флуазифопа-П из анализируемого объекта органическими растворителями, щелочной гидролиз эфира до кислоты, переэкстракцию после подкисления в органическую среду, бутилирование и очистку экстракта на колонке с силикагелем. Количественное определение флуазифоп-П-бутила проводят методом абсолютной калибровки.

2.1.2. Избирательность метода

Присутствие других пестицидов, близких по химическому строению и области применения, определению не мешает.

2.1.3. Метрологическая характеристика метода

Метрологическая характеристика метода представлена в таблицах 1 и 2 (см. приложение - не приводится).

Аналитический стандарт флуазифоп-П-бутила 95,1%.

Азот газообразный высокой чистоты, ТУ 301-07-25-89.

Ацетон, ос.ч., ТУ 2633-004-11291058-94.

Ацетонитрил для хроматографии, х.ч., ТУ 6-09-4326-76.

н-Бутанол, х.ч., ГОСТ 6006-78, свежеперегнанный.

н-Гексан, х.ч., ТУ 6-09-3375-78.

Калия гидроксид, ч.д.а., ГОСТ 24363-80.

Натрий сернокислый б/в, ч.д.а., ГОСТ 4166-76.

Натрий хлористый, ч.д.а., ГОСТ 4233-77.

Натрия гидроксид, ч.д.а., ГОСТ 4328-77.

Силикагель 60 (0,040 - 0,063 мм) производства "Мерк".

Соляная кислота, х.ч., ГОСТ 3118-77.

Фильтры бумажные красная лента, ТУ 2642-001-42624157-98.

Фильтры бумажные белая лента, ТУ 6-09-1678.

Эфир диэтиловый (серный), ОСТ 84-2006-88.

Этилацетат, х.ч., ГОСТ 22300-76.

Этиловый спирт, ректификат (96%), ТУ 6-09-19100-77.

Хроматограф газовый "Кристалл 2000М" с ДЭЗ или аналогичный по своим техническим характеристикам.

Колонка хроматографическая капиллярная кварцевая длиной 20 м, внутренним диаметром 0,53 мм с неподвижной фазой НР-1, толщина слоя - 0,53 мкм.

Весы аналитические типа ВЛА-200, ГОСТ 34104-80.

Весы лабораторные типа ВЛКТ-500, ГОСТ 24104-80.

Вода дистиллированная, ГОСТ 6709-72.

Воронка Бюхнера, ГОСТ 9147.

Воронки делительные емкостью 25, 250, 500 и 1000 мл, ГОСТ 25336-82.

Воронки химические конусные, ГОСТ 25336-82.

Индикаторная бумага универсальная, ТУ 6-09-1181-76.

Колбы-концентраторы емкостью 100, 250 и 500 мл, ГОСТ 25336-82.

Колбы плоскодонные емкостью 300 мл, ГОСТ 25336-82.

Колбы мерные со шлифом емкостью 25, 50, 100 мл, ГОСТ 1770-74.

Мельница электрическая лабораторная, ТУ 46-22-236-79, или аналогичная.

Микрошприц МШ-10, ТУ 2-833-106.

Пипетки мерные емкостью 1, 2, 5 и 10 мл, ГОСТ 20292-74.

Пробирки мерные со шлифом емкостью 5,0 мл, ГОСТ 1770-74.

Стаканы химические на 100, 200 и 500 мл, ГОСТ 25336-82.

Стеклянные палочки.

Ротационный испаритель вакуумный Buchi R-200 или аналогичный.

Установка для упаривания растворителей в токе азота.

Ванна ультразвуковая "Серьга" УЗМ002 или аналогичная.

Баня водяная, ТУ 64-1-1411-76.

Хроматографические стеклянные колонки длиной 350 мм, диаметром 10 мм.

Чашка фарфоровая, ГОСТ 9147-80Е.

2.4.1. Подготовка и очистка растворителей

Перед началом работы рекомендуется проверить чистоту применяемых органических растворителей. Для этого 100 мл растворителя упаривают в ротационном вакуумном испарителе при температуре +40 °С до объема 1,0 мл и хроматографируют. При обнаружении мешающих определению примесей очистку растворителей производят в соответствии с общепринятыми методами.

2.4.2. Приготовление растворов

Основной стандартный раствор флуазифоп-П-бутила с содержанием 100 мкг/мл готовят растворением в гексане 0,01 г аналитического стандарта в мерной колбе емкостью 100 мл. Раствор хранят в холодильнике при температуре +4 - 6 °С в течение месяца. Градуировочные растворы с концентрациями 0,2; 0,4; 1,0 и 2,0 мкг/мл готовят из основного раствора флуазифоп-П-бутила методом последовательного разбавления по объему гексаном.

Для внесения в лук используют градуировочные растворы с концентрацией 0,2; 0,4; 1,0; 2,0 мкг/мл в ацетоне.

Для внесения в семена и масло рапса, подсолнечника, зерно и масло сои используют растворы 0,5; 1; 2,5 и 5 мкг/мл, приготовленные из основного раствора разбавлением гексаном.

Для внесения в горох используют растворы 0,75; 1,5; 3,75 и 7,5 мгк/мл, приготовленные из основного раствора разбавлением смесью гексан: ацетон (1:1).

Раствор для бутилирования: к 80 мл н-бутанола в мерной колбе на 100 мл осторожно добавляют 2 мл концентрированной серной кислоты, перемешивают и доводят до метки н-бутанолом. Раствор готовят непосредственно перед анализом.

2.4.3. Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика в инжектор хроматографа вводят по 1 мкл приготовленных градуировочных растворов с концентрациями 0,2; 0,4; 1,0; 2,0 мкг/мл. Осуществляют не менее трех параллельных измерений и находят среднее значение высоты (площади) хроматографического пика для каждой концентрации. Строят график зависимости высоты (площади) хроматографического пика в мм (кв. мм) от концентрации стандарта в градуировочном растворе в мкг/мл.

2.4.4. Подготовка хроматографической колонки для очистки экстрактов

В нижнюю часть стеклянной колонки диаметром 10 мм и длиной 25 - 30 мм помещают тампон из промытой стекловаты. Приготавливают суспензию 5 г силикагеля в гексане. Частично заполняют колонку гексаном и через воронку вливают суспензию сорбента непрерывной струей. Дают растворителю слиться через кран, чтобы сорбент осел, и уплотняют сорбент легким постукиванием, не допуская падения уровня растворителя ниже уровня сорбента. Дополнительно в верхнюю часть колонки над сорбентом помещают слой безводного сульфата натрия (1 - 1,5 г). Через колонку пропускают последовательно 10 мл гексана и 10 мл исходного элюента - смеси гексан:этилацетат (9:1). Уровень растворителей над слоем сульфата натрия должен составлять 10 - 15 мм, после этого кран закрывают. Колонка готова к работе.

2.4.5. Подготовка приборов и средств измерения

Установка и подготовка всех приборов и средств измерения проводится в соответствии с требованиями технической документации.

Отбор проб семян рапса, сои, подсолнечника для анализа проводят в соответствии с ГОСТ 10852-86 "Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб". Отбор проб гороха проводят в соответствии с ГОСТ 28674-90 "Горох. Требования при заготовке и поставке" или ГОСТ 5312-90 "Горох овощной свежий для консервирования". Отбор проб лука проводят в соответствии с ГОСТ 1723-86 "Лук репчатый свежий, заготовляемый и поставляемый" и ГОСТ 27166-86 "Лук репчатый свежий реализуемый".

Для длительного хранения аналитические пробы лука репчатого помещают в морозильную камеру с температурой -18 °С и хранят в закрытой полиэтиленовой таре.

Пробы семян рапса, сои, подсолнечника и гороха подсушивают до стандартной влажности и хранят в закрытой стеклянной или полиэтиленовой таре при комнатной температуре.

Пробы масла рапса, сои, подсолнечника хранят в холодильнике при +4 - 6 °С в закрытой стеклянной таре.

2.6.1. Экстракция и очистка экстрактов

2.6.1.1. Семена рапса и подсолнечника, зерно сои и гороха

Аналитическую пробу массой 25 г растертых в ступке семян рапса, измельченных семян подсолнечника и зерна сои или 50 г зерна гороха помещают в плоскодонную колбу емкостью 250 мл, заливают 100 - 150 мл ацетона и проводят экстракцию в ультразвуковой ванне в течение 10 мин. Суспензию фильтруют с помощью воронки Бюхнера (фильтр "белая лента") с последующей промывкой фильтра 50 мл ацетона. Экстракт переносят в делительную воронку емкостью 500 мл, добавляют 150 мл 0,5%-ного водного раствора гидроксида калия (pH 9, контроль по индикаторной бумаге) и выдерживают смесь в течение 1 часа. Затем в воронку добавляют 50 мл насыщенного раствора хлорида натрия и 50 мл гексана. Воронку встряхивают в течение 2-х минут и после разделения фаз отбирают нижний водно-ацетоновый слой, гексановый слой отбрасывают. Водно-ацетоновый слой повторно промывают 50 мл гексана в делительной воронке. Водно-ацетоновый слой собирают в плоскодонную колбу на 500 мл и подкисляют 2 - 3 мл концентрированной HCl (до pH 1 - 2, контролируя по индикаторной бумаге). Затем экстракт переносят в делительную воронку на 500 мл и экстрагируют флуазифоп-П 100 мл диэтилового эфира, экстракцию повторяют дважды порциями по 50 мл. Отделение диэтиловой фракции проводят после полного разделения слоев. Диэтиловый экстракт фильтруют в колбу-концентратор через слой безводного сульфата натрия и концентрируют на вакуумном роторном испарителе при температуре не выше 30 °С до объема 5 - 7 мл, затем до сухого остатка в токе азота при комнатной температуре. Сухой остаток бутилируют по п. 2.6.2.

2.6.1.2. Лук

Навеску лука 20 г, отобранную из усредненной измельченной пробы, помещают в круглодонную колбу со шлифом на 250 мл, добавляют 50 мл этанола и 10 мл 40%-ного водного раствора гидроксида натрия, слегка встряхивают и добавляют вторую порцию 50 мл этанола. Колбу помещают в водяную баню, присоединяют обратный холодильник и содержимое колбы кипятят в течение 1 часа. После этого колбу отсоединяют и быстро охлаждают под струей холодной воды, содержимое фильтруют через складчатый фильтр "красная лента" в делительную воронку емкостью 500 мл. Колбу и осадок на фильтре промывают 30 мл этанола. К содержимому делительной воронки добавляют 50 мл дистиллированной воды, 10 мл насыщенного водного раствора хлористого натрия и несколько мл концентрированной HCl до pH 5, контролируя по индикаторной бумаге. Содержимое воронки перемешивают и добавляют 50 мл гексана. Воронку встряхивают в течение 2 минут и после разделения фаз отбирают гексановый слой, пропуская его через безводный сульфат калия в колбу-концентратор на 250 мл. Водно-спиртовой слой еще дважды экстрагируют гексаном порциями по 50 мл и фильтруют в ту же колбу-концентратор. Объединенный экстракт концентрируют на вакуумном ротационном испарителе при температуре не выше 40 °С до объема 5 - 7 мл, затем досуха в токе азота при комнатной температуре. Сухой остаток бутилируют по п. 2.6.2.

2.6.1.3. Масло сои, рапса, подсолнечника

Аналитическую пробу масла массой 25 г растворяют в 100 мл гексана (насыщенного ацетонитрилом) в плоскодонной колбе емкостью 200 мл и переносят гексановый раствор масла в делительную воронку емкостью 500 мл. Колбу промывают 150 мл ацетонитрила (насыщенного гексаном) и также переносят его в воронку. Содержимое воронки встряхивают в течение 2-х минут. После разделения фаз нижний ацетонитрильный слой собирают в плоскодонную колбу объемом 500 мл. В делительную воронку добавляют еще 100 мл ацетонитрила и процедуру повторяют. К объединенному ацетонитрильному экстракту добавляют 150 мл 1%-ного раствора гидроксида калия и выдерживают смесь в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем смесь переносят в делительную воронку на 1000 мл, добавляют 50 мл насыщенного раствора хлорида натрия и 100 мл гексана. Воронку встряхивают в течение 2 минут и после разделения фаз собирают ацетонитрильный слой, который повторно промывают 100 мл гексана. Ацетонитрильный экстракт помещают в чистую делительную воронку на 1000 мл, подкисляют его несколькими мл концентрированной HCl до pH 1 - 2, перемешивают содержимое и добавляют 100 мл диэтилового эфира. Воронку встряхивают в течение 2 минут и после полного разделения фаз диэтиловую фракцию отбирают в колбу-концентратор на 250 мл, пропуская ее через слой безводного сульфата натрия. Водно-ацетонитрильный слой повторно экстрагируют 100 мл диэтилового эфира. Объединенный диэтиловый экстракт концентрируют на ротационном испарителе при температуре не выше 30 °С до объема 5 - 7 мл, затем досуха в токе азота при комнатной температуре. Сухой остаток бутилируют по п. 2.6.2.

2.6.2. Бутилирование

К сухому остатку в концентраторе добавляют 1 мл 2%-ного раствора концентрированной серной кислоты в бутаноле. Реакцию проводят в плотно закрытом концентраторе в течение часа при 100 °С. По окончании реакции концентратор охлаждают и добавляют в него 10 мл гексана и 10 - 15 мл дистиллированной воды. Содержимое переносят в делительную воронку на 25 мл и встряхивают в течение 2-х минут. После разделения слоев верхний гексановый слой отделяют в чистый флакон (типа пенициллинового) емкостью 20 мл, пропуская через слой безводного сульфата натрия. Затем экстракт чистят на колонке с силикагелем. Для очистки на колонке с силикагелем гексановый экстракт выпаривают в токе азота при температуре 40 °С. Сухой остаток растворяют в 1 мл смеси гексан:этилацетат (9:1).

2.6.3. Очистка на колонке с силикагелем

Доводят уровень элюента в колонке чуть выше слоя сорбента. Раствор, подготовленный для очистки, из пипетки осторожно прикапывают в подготовленную колонку и сливают часть растворителя до уровня чуть выше слоя сорбента. Пробирку обмывают 1 мл смеси гексан:этилацетат (9:1), прикапывают в колонку и снова сливают часть растворителя до уровня чуть выше сорбента. Тщательно смывают стенки колонки небольшим количеством элюента и снова сливают часть растворителя до уровня чуть выше сорбента. Осторожно заполняют колонку 20 мл гексана, стараясь не нарушить верхний слой набивки. Гексан пропускают через колонку и отбрасывают. Затем элюирование продолжают 10 мл смеси гексан:этилацетат (3:2), которые отбрасывают, следующие 10 мл того же элюента собирают в колбу-концентратор и упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 1 мл гексана и хроматографируют.

2.6.4. Условия хроматографирования

Газовый хроматограф "Кристалл 2000М" с электронозахватным детектором.

Колонка капиллярная кварцевая длиной 20 м, внутренним диаметром 0,53 мм с неподвижной фазой НР-1, толщина слоя - 1,5 мкм.

Температура колонки: программирование от 190 °С (1 мин.) до 210 °С со скоростью 10 °С/мин. Температура испарителя - 250 °С. Температура детектора - 300 °С.

Расход газа-носителя (азот) - 10 куб. см/мин., объем вводимой пробы 1 мкл.

Время удерживания флуазифоп-П-бутила 10 мин. - 15 с +/- 5 с.

Линейный диапазон детектирования: 0,2 - 2,0 нг.

2.6.5. Обработка результатов анализа

Содержание флуазифоп-П-бутила в пробе рассчитывают методом внешнего стандарта по формуле:

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор флуазифоп-П-бутила 2 мкг/мл, разбавляют гексаном.

При работе с реактивами соблюдать требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1.005-88). При выполнении измерений с использованием газового хроматографа соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцией по эксплуатации прибора.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости результатов измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

Всероссийский институт защиты растений, Санкт-Петербург.