"МУК 4.1.1980-05. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств протиоконазола и его основного метаболита протиоконазола-дестио в воде, протиоконазола и протиоконазола-дестио по метаболиту протиоконазолу-дестио в почве методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 21.04.2005)

Настоящие методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации протиоконазола и его основного метаболита протиоконазола-дестио в воде в диапазоне 0,0005 - 0,01 мг/куб. дм, протиоконазола и протиоконазола-дестио по метаболиту протиоконазолу-дестио в почве в диапазоне 0,01 - 0,2 мг/кг.

2-[(RS)-2-гидрокси-2-(1-хлорциклопропил)-3-(2-хлорфенил) пропил]-2H-1,2,4-триазол-3(4H)-тион(IUPAC).

Структурная формула (не приводится).

Молекулярная масса: 344,3.

Краткая токсикологическая характеристика

Протиоконазол не оказывает раздражающего действия на кожу и слизистую оболочку глаз.

Основной метаболит протиоконазола: протиоконазол-дестио (SXX0665)

альфа-(1-хлорциклопропил)-альфа-(2-хлорфенил)метил-1H-1,2,4-триазол-1 этанол (С.А.).

Структурная формула (не приводится).

Молекулярная масса: 312,2.

Область применения препарата

Протиоконазол - фунгицид системного действия из группы ингибиторов синтеза эргостерина. Вещество обладает защитным, искореняющим и лечебным действием.

Метрологические характеристики метода представлены в таблице.

Методика основана на определении веществ с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовым детектором. Для концентрирования и очистки пробы воды использованы патроны для твердофазной экстракции C18 Sep Pak. Контроль протиоконазола и его основного метаболита протиоконазола-дестио в образцах почвы осуществляется по содержанию протиоконазола-дестио после экстракции из анализируемого образца смесью ацетонитрил - вода, очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей, а также на колонке с оксидом алюминия.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичной или более высокой квалификацией.

Допускается применение другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на жидкостном хроматографе.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией "лаборант", имеющего опыт работы в химической лаборатории.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °С и относительной влажности не более 80%.

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление растворов, подвижной фазы для ВЭЖХ, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики, подготовка колонки с оксидом алюминия и концентрирующих патронов C18 Sep Pak.

7.1.1. Очистка ацетонитрила

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора не менее 1 часа, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия.

7.1.2. Очистка н-гексана

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до прекращения ее окрашивания в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над поташом.

7.1.3. Очистка этилацетата

Этилацетат промывают последовательно 5%-м водным раствором карбоната натрия, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над безводным карбонатом калия, перегоняют или подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретических тарелок не менее 50.

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 1,36 куб. см 85%-й ортофосфорной кислоты, доводят водой до метки, тщательно перемешивают.

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 300 - 400 куб. см дистиллированной воды, вносят 0,5 куб. см ледяной уксусной кислоты, перемешивают, доводят водой до метки, вновь перемешивают.

Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см, внутренним диаметром 8 - 10 мм уплотняют тампоном из стекловаты, медленно выливают в колонку (при открытом кране) суспензию 5 г оксида алюминия в 15 - 20 куб. см смеси гексан - этилацетат (85:15, по объему). Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку промывают 20 см этилацетата со скоростью 1 - 2 капли в с, затем 20 куб. см смеси гексан - этилацетат (85:15, по объему). После этого колонка готова к работе.

В круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 0,5 куб. см градуировочного раствора N 1 протиоконазола-дестио с концентрацией 10 мкг/куб. см в ацетонитриле (п. 7.9.2), раствор упаривают досуха, остаток растворяют в 0,5 куб. см этилацетата, помещая на ультразвуковую баню на 1 мин., добавляют 2,5 куб. см гексана, перемешивают, вновь помещают на ультразвуковую баню на 1 мин. Раствор наносят на колонку, подготовленную по п. 7.4. Промывают колонку 25 куб. см смеси гексан - этилацетат (85:15, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в сек., элюат отбрасывают. Затем колонку промывают 50 куб. см смеси гексан - этилацетат (60:40, по объему). Фракционно (по 10 куб. см) отбирают элюат, упаривают, остатки растворяют в 1 куб. см ацетонитрила, помещая на ультразвуковую баню на 1 мин., вносят 1 куб. см подвижной фазы, подготовленной по п. 7.3, перемешивают и анализируют на содержание протиоконазола-дестио по п. 9.3.

Концентрирующий патрон промывают с помощью медицинского шприца 2 куб. см метанола со скоростью прохождения растворителя через патрон 1 - 2 капли в с, затем 5 куб. см 0,05%-ного раствора уксусной кислоты. Патрон готовят непосредственно перед использованием для концентрирования образца.

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 600 куб. см ацетонитрила, 400 см 0,02 М раствора ортофосфорной кислоты, перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр.

Промывают колонку подвижной фазой (приготовленной по п. 7.7) при скорости подачи растворителя 1 куб. см/мин. не менее 2-х часов до установления стабильной базовой линии.

7.9.1. Исходные растворы протиоконазола и протиоконазола-дестио для градуировки (концентрация 500 мкг/куб. см). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 0,05 г протиоконазола (или протиоконазола-дестио), растворяют в 40 - 50 куб. см ацетонитрила, доводят ацетонитрилом до метки, тщательно перемешивают.

Растворы хранят в морозильной камере при температуре не выше - 18 °С в течение 3-х месяцев.

7.9.2. Растворы протиоконазола и протиоконазола-дестио N 1 для градуировки (концентрация 10 мкг/куб. см). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 2 куб. см исходного раствора протиоконазола (или протиоконазола-дестио) с концентрацией 500 мкг/куб. см (п. 7.9.1), разбавляют ацетонитрилом до метки.

Этот раствор используют для приготовления проб воды с внесением при оценке полноты извлечения протиоконазола и протиоконазола-дестио из исследуемых образцов. Для внесения в образцы почвы используют растворы с концентрацией 10 мкг/куб. см, приготовленные в смеси метанол - вода - цистеин гидрохлорид (100:900:0,01; объем/объем/вес).

Градуировочные растворы N 1 хранят в морозильной камере при температуре не выше - 18 °С в течение месяца.

7.9.3. Рабочие растворы N 2 - 5 протиоконазола и протиоконазола-дестио для градуировки (концентрация 0,05 - 1,0 мкг/см).

В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают по 0,5; 1,0; 5,0 и 10,0 куб. см градуировочного раствора N 1 протиоконазола (или протиоконазола-дестио) с концентрацией 10 мкг/куб. см (п. 7.9.2), доводят до метки подвижной фазой, приготовленной по п. 7.7, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 2 - 5 с концентрацией протиоконазола (или протиоконазола-дестио) 0,05; 0,1; 0,5 и 1,0 мкг/куб. см, соответственно.

Растворы готовят непосредственно перед употреблением.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (отн. единицы) от концентрации протиоконазола (или протиоконазола-дестио) в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки.

В инжектор хроматографа вводят по 20 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.3. Осуществляют не менее 3 параллельных измерений.

Отбор проб производится в соответствии с правилами, определенными ГОСТами Р 51592-2000 "Вода. Общие требования к отбору проб", 1743.01-83 "Почвы. Общие требования к отбору проб", 26950-89 "Почвы. Отбор проб".

Пробы воды анализируют в день отбора или замораживают и хранят в полиэтиленовой таре в морозильной камере при температуре -18 °С не более 2 недель.

Образцы почвы подсушивают на воздухе в темноте, помещают в герметичную полиэтиленовую тару и хранят в холодильнике при температуре 4 - 6 °С не более 4 недель.

Для длительного хранения образцы почвы замораживают и хранят при температуре -18 °С.

Перед анализом образцы воды фильтруют через неплотный бумажный фильтр, почвы - просеивают через сито с диаметром отверстий 1 мм.

Образец отфильтрованной воды объемом 200 куб. см помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 - 300 куб. см с пришлифованной пробкой, вносят 0,01 г цистеина гидрохлорида и 0,1 куб. см ледяной уксусной кислоты, тщательно перемешивают.

Подготовленную пробу вносят с помощью медицинского шприца на концентрирующий патрон C18 Sep Pak, подготовленный по п. 7.6, со скоростью пропускания раствора 1 - 2 капли в с. Операцию осуществляют в затемненном помещении. После нанесения пробы патрон промывают 5 см смеси ацетонитрил - 0,05%-ая уксусная кислота (2:8, по объему), элюат отбрасывают. Вещества элюируют с патрона 2 куб. см смеси ацетонитрил - 0,05%-ая уксусная кислота (9:1, по объему), собирая элюат в градуированную пробирку с пришлифованной пробкой, перемешивают и анализируют на содержание протиоконазола и протиоконазола-дестио по п. 9.3.

9.2.1. Экстракция

Образец суховоздушной почвы массой 20 г помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 куб. см, добавляют 100 куб. см смеси ацетонитрил - вода (80:20, по объему) и помещают на встряхиватель на 1 ч.

Раствор (с осадком почвы) фильтруют в мерный цилиндр вместимостью 100 куб. см с пришлифованной пробкой через складчатый бумажный фильтр, помещенный на конусную воронку. Осадок на фильтре промывают 25 куб. см смеси ацетонитрил - вода (80:20, по объему). Экстракт и промывную жидкость, объединенные в мерном цилиндре, перемешивают, измеряют объем раствора, 1/2 его часть (эквивалентную 10 г образца) переносят в круглодонную колбу. Далее проводят очистку экстракта по п. 9.2.2.

9.2.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей

Экстракт, полученный по п. 9.2.1 и помещенный в круглодонную колбу, упаривают на ротационном вакуумном испарителе до водного остатка (~ 10 куб. см) при температуре не выше 35 °С, внимательно следя за процессом и не допуская переброса жидкости при вспенивании. К водному остатку прибавляют 40 куб. см деионизованной воды и 5 г хлорида натрия, перемешивают до полного растворения соли и переносят в делительную воронку вместимостью 250 куб. см. В воронку вносят 30 куб. см хлористого метилена, интенсивно встряхивают воронку в течение 2 мин. После полного разделения фаз нижний органический слой отделяют, фильтруют через слой безводного сульфата натрия, помещенный на бумажном фильтре в конусной воронке, в круглодонную колбу вместимостью 150 куб. см. Операцию экстракции водной фазы повторяют еще дважды, используя по 25 куб. см хлористого метилена. Объединенную органическую фазу, пропущенную через слой сульфата натрия, упаривают досуха и подвергают дополнительной очистке на колонке по п. 9.2.3.

9.2.3. Очистка экстракта на колонке с оксидом алюминия

Остаток в круглодонной колбе, полученный по п. 9.2.2, растворяют в 0,5 куб. см этилацетата, помещая на ультразвуковую баню на 1 мин., добавляют 2,5 куб. см гексана, перемешивают, вновь помещают на ультразвуковую баню на 1 мин. Раствор наносят на колонку, подготовленную по п. 7.4. Колбу обмывают трижды порциями по 3 куб. см смеси гексан - этилацетат (85:15, по объему), которые также наносят на колонку. Промывают колонку 25 куб. см смеси гексан - этилацетат (85:15, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в с, элюат отбрасывают. Протиоконазол-дестио элюируют с колонки 40 куб. см смеси гексан - этилацетат (60:40, по объему), собирая элюат непосредственно в круглодонную колбу. Раствор упаривают досуха при температуре не выше 35 °С. Остаток в колбе растворяют в 1 куб. см ацетонитрила, помещая на ультразвуковую баню на 1 мин., вносят 1 куб. см подвижной фазы, подготовленной по п. 7.3, перемешивают и анализируют на содержание протиоконазола-дестио по п. 9.3.

Жидкостный хроматограф с ультрафиолетовым детектором (фирмы Perkin-Elmer, США).

Колонка стальная длиной 25 см, внутренним диаметром 4 мм, содержащая кромасил 100 C18, зернением 8 мкм.

Температура колонки: комнатная.

Подвижная фаза: ацетонитрил - 0,02 М ортофосфорная кислота (60:40, по объему).

Скорость потока элюента: 1 куб. см/мин.

Рабочая длина волны: 213 нм.

Чувствительность: 0,01 ед. абсорбции на шкалу.

Объем вводимой пробы: 20 куб. мм.

Ориентировочное время выхода протиоконазола-дестио: 6,4 - 6,6 мин.; протиоконазола: 9,4 - 9,7 мин.

Линейный диапазон детектирования 1 - 20 нг.

Образцы, дающие пики, большие, чем градуировочные растворы с концентрацией 1,0 мкг/куб. см, разбавляют подвижной фазой, приготовленной по п. 7.3.

Содержание протиоконазола в пробе с учетом его основного метаболита протиоконазола-дестио в эквиваленте действующего вещества (Х, мг/куб. дм) рассчитывают по формуле:

где:

А, Б - концентрации протиоконазола и протиоконазола-дестио, соответственно, найденные по градуировочным графикам, мкг/куб. см;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;

W - объем анализируемого образца, куб. см.

К - коэффициент пересчета содержания протиоконазола-дестио на эквивалент протиоконазола по соотношению молекулярных масс (равен 1,103).

Содержание протиоконазола в пробе с учетом его основного метаболита протиоконазола-дестио в эквиваленте действующего вещества (Х, мг/кг) рассчитывают по формуле:

где:

Б - концентрация протиоконазола-дестио, найденная по градуировочному графику, мкг/куб. см;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;

m - масса анализируемого образца, г.

К - то же, что и в п. 10.1.

С - коэффициент пересчета на полный объем экстракта (равен 2).

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

Юдина Т.В., Федорова Н.Е., Волкова В.Н. (Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана); Брагина И.В. (Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора).