"МУК 4.1.1945-05. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методические указания по определению остаточных количеств диквата в моркови, луке, семенах и масле сои методом высокоэффективной жидкостной хроматографии"
(утв. Роспотребнадзором 18.01.2005)

1. Методические указания подготовлены Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана при участии специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко.

4. Введены впервые.

Настоящие Методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения в моркови, луке, семенах и масле сои массовой концентрации диквата в диапазонах 0,025 - 0,05 мг/кг (морковь, лук) и 0,05 - 1,0 мг/кг (семена и масло сои).

Дикват - действующее вещество препарата Реглон Супер, ВР (150 г/л), фирма производитель Сингента АГРО АГ, Швейцария.

1,1'-этилен-2,2'-дипиридилий; 9,10-дигидро-8а,10а-диазонийфенантрен (ИЮПАК).

Структурная формула (не приводится).

Мол. масса 184,2.

1,1'-этилен-2,2'-дипиридилий используется в виде дибромида:

1,1-этилен-2,2-дипиридилий дибромид (ИЮПАК).

Структурная формула (не приводится).

Гигиенические нормативы для дикват дибромида: ОДК в почве - 0,2 мг/кг; ПДК в воде водоемов - 0,02 мг/куб. дм; МДУ в горохе - 0,05 мг/кг, в семенах подсолнечника - 0,5 мг/кг и в подсолнечном масле - 0,1 мг/кг.

Область применения препарата

Дикват дибромид - контактный гербицид сплошного действия. Используется для уничтожения однолетних широколистных сорняков в виноградниках, садах, посевах овощных и декоративных культур, водной растительности в водоемах, а также для предуборочной десикации семенников сахарной свеклы, клевера, сорго, подсолнечника, льна, хлопчатника, рапса, сои, риса. Применяется в дозах от 0,4 до 1,0 кг/га.

Метрологические характеристики метода представлены в таблицах 1 и 2.

Методика основана на определении вещества с помощью ион-парной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовым детектором после экстракции из анализируемых проб серной кислотой при кипячении, очистки экстрактов на колонке с катионитом, а также на патроне для твердофазной экстракции С18 Sep Pak.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичной или более высокой квалификацией.

Допускается применение другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами по ГОСТу 12.1.005.

4.2. При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТом 12.1.019 и инструкцией по эксплуатации прибора.

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на жидкостном хроматографе.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °С и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка ацетонитрила (при необходимости), приготовление растворов, подвижной фазы для ВЭЖХ, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики, подготовка колонки с катионитом и патронов для очистки экстрактов.

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора не менее 1 часа, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия.

Навеску гидроксида натрия массой 3 г помещают в мерную колбу вместимостью 250 куб. см, растворяют в 100 - 150 куб. см дистиллированной воды, доводят водой до метки, перемешивают.

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 25 г хлорида аммония, растворяют в 600 - 700 куб. см дистиллированной воды, доводят водой до метки, перемешивают.

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 50 г двунатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты, растворяют в 600 - 700 куб. см дистиллированной воды, доводят водой до метки, перемешивают.

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 500 куб. см дистиллированной воды, вносят 167 куб. см концентрированной соляной кислоты, доводят водой до метки, перемешивают.

Навеску катионита Дауэкс 50 в натриевой форме <*> массой 3,5 г (при исследовании моркови и лука), 10 г (при исследовании семян и масла сои) помещают в стакан вместимостью 100 куб. см, заливают 40 - 25 куб. см воды. Через 30 мин. суспензию переносят в хроматографическую колонку длиной 25 см, внутренним диаметром 10 мм, нижняя часть которой уплотнена тампоном из стекловаты. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента, затем колонку последовательно промывают 20 куб. см насыщенного раствора хлорида натрия и 50 куб. см дистиллированной воды со скоростью 3 - 5 куб. см/мин., после чего она готова к работе.

--------------------------------

Концентрирующий патрон промывают с помощью медицинского шприца 2 куб. см метанола со скоростью прохождения растворителя через патрон 10 - 20 куб. см/мин. (время пропускания растворителя через патрон составляет около 10 сек.). Патрон подготавливают непосредственно перед использованием для очистки экстракта.

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 405 куб. см деионизированной воды, 95 куб. см ацетонитрила, перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр. В раствор вносят 5 куб. см орто-фосфорной кислоты, 5 куб. см диэтиламина, 0,5 г октансульфоната натрия, перемешивают и помещают на ультразвуковую баню на 2 мин.

Промывают колонку подвижной фазой (приготовленной по п. 7.8) при скорости подачи растворителя 1 куб. см/мин. не менее 2-х часов до установления стабильной базовой линии.

7.10.1. Исходный раствор диквата для градуировки (концентрация катиона диквата 1 мг/куб. см)

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 0,1965 г диквата дибромида моногидрата (молекулярная масса 362,1, содержание катиона 50,9%), растворяют в 40 - 50 куб. см насыщенного водного раствора хлорида аммония, доводят насыщенным раствором хлорида аммония до метки, тщательно перемешивают.

7.10.2. Раствор диквата N 1 для градуировки (концентрация 100 мкг/куб. см)

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 10 куб. см исходного раствора диквата с концентрацией 1 мг/куб. см (п. 7.10.1), разбавляют насыщенным раствором хлористого аммония до метки.

Этот раствор используют для приготовления проб моркови, лука, семян сои с внесением при оценке полноты извлечения диквата из исследуемых образцов. Для внесения в образцы масла сои используют раствор с концентрацией 100 мкг/куб. см, приготовленный в смеси 2,5%-ный раствор хлорида аммония - ацетон - гексан (1:4:5, по объему).

7.10.3. Раствор диквата N 2 дня градуировки (концентрация 10 мкг/куб. см)

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 10 куб. см раствора N 1 с концентрацией 100 мкг/куб. см (п. 7.10.2), разбавляют насыщенным раствором хлористого аммония до метки.

Растворы хранят при комнатной температуре в темноте в течение 12-ти месяцев.

7.10.4. Рабочие растворы N 3 - 7 диквата для градуировки (концентрация 0,05 - 1,0 мкг/куб. см)

В 5 мерных колб вместимостью 100 куб. см помещают по 0,5; 1,0; 2,5; 5,0 и 10,0 куб. см градуировочного раствора N 2 с концентрацией 10 мкг/куб. см (п. 7.10.3), доводят до метки насыщенным раствором хлорида аммония, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 3 - 7 с концентрацией диквата 0,05; 0,1; 0,25; 0,5 и 1,0 мкг/куб. см соответственно.

Растворы хранят при комнатной температуре в темноте.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (мВ х сек.) от концентрации диквата в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 5-ти растворам для градуировки.

В инжектор хроматографа вводят по 20 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.4. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений.

Отбор проб производится в соответствии с правилами, определенными ГОСТами 11121-82 и 26313-84.

Отобранные пробы моркови и лука хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике не более 10-ти дней. Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре -18 °С.

Пробы семян (помещенные в тканевую или бумажную упаковку) и масла сои (помещенные в стеклянные флаконы) хранят в темноте при комнатной температуре в течение 3-х месяцев.

Перед анализом образцы моркови, лука и семян сои измельчают.

9.1.1. Морковь, лук, семена сои

Образец измельченного лука и моркови массой 100 г, семян сои массой 50 г помещают в круглодонную колбу вместимостью 2000 куб. см, вносят 400 куб. см (при исследовании лука и моркови) или 450 куб. см (при исследовании семян сои) деионизированной воды. Осторожно приливают 15 куб. см концентрированной серной кислоты. Колбу с подсоединенным к ней обратным холодильником и елочным дефлегматором помещают на электрический колбонагреватель и кипятят ее содержимое в течение 5 час. Реакционную массу охлаждают. На этой стадии можно оставить раствор на ночь. Остывшую суспензию фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через фильтр из хроматографической бумаги Ватман 3ММ (или бумажный фильтр "красная лента" в 2 слоя). Осадок на фильтре промывают двумя порциями дистиллированной воды по 100 куб. см. Переливают фильтрат в химический стакан вместимостью 2 куб. дм, доводят pH до 8 - 9 (по индикаторной бумаге) добавлением твердого гидроксида натрия (20 - 25 г) при постоянном перемешивании. Добавляют 50 куб. см раствора ЭДТУ (приготовленного по п. 7.4), перемешивают, контролируют pH раствора (по индикаторной бумаге), если его значение выходит из диапазона 6 - 7, доводят его значение до указанных показателей, добавляя по каплям растворы ЭДТУ или гидроксида натрия. Снова фильтруют раствор под вакуумом на воронке Бюхнера через фильтр из хроматографической бумаги Ватман 3ММ (или бумажный фильтр "красная лента" в 2 слоя), промывая стакан и фильтр 100 куб. см дистиллированной воды. Фильтраты объединяют, доводят общий объем раствора до 1 куб. дм и подвергают очистке по п. 9.2.

9.1.2. Масло сои

Образец масла массой 50 г помещают в круглодонную колбу вместимостью 2000 куб. см, вносят 450 куб. см деионизированной воды. Осторожно приливают 15 куб. см концентрированной серной кислоты. Колбу с подсоединенным к ней обратным холодильником и елочным дефлегматором помещают на электрический колбонагреватель и кипятят ее содержимое в течение 5 час. Реакционную массу охлаждают. На этой стадии можно оставить раствор на ночь. Остывший раствор переносят в делительную воронку вместимостью 1000 куб. см, нижний водный слой отделяют, помещая в химический стакан вместимостью 2 куб. дм, доводят pH до 8 - 9 (по индикаторной бумаге) добавлением твердого гидроксида натрия (около 24 г) при постоянном перемешивании. Добавляют 50 куб. см раствора ЭДТУ (приготовленного по п. 7.4), перемешивают, контролируют pH раствора (по индикаторной бумаге), если его значение выходит из диапазона 6 - 7, доводят его значение до указанных показателей, добавляя по каплям растворы ЭДТУ или гидроксида натрия. Фильтруют раствор под вакуумом на воронке Бюхнера через фильтр из хроматографической бумаги Ватман 3ММ (или бумажный фильтр "красная лента" в 2 слоя), промывая стакан и фильтр 100 куб. см дистиллированной воды. Фильтраты объединяют, доводят общий объем раствора до 1 куб. дм и подвергают очистке по п. п. 9.2 и 9.3.

Объединенный фильтрат, полученный по п. 9.1.1 или 9.1.2, вводят со скоростью 5 куб. см/мин. в хроматографическую колонку, подготовленную по п. 7.6. С этой целью фильтрат переносят в делительную воронку, помещенную над колонкой, устанавливают (регулируя кран) скорость пропускания раствора 5 куб. см/мин. После введения пробы колонку последовательно промывают 25 куб. см воды, 50 куб. см 2 н хлороводородной кислоты, 25 куб. см воды, 100 куб. см 2,5%-ного раствора хлорида аммония и 25 куб. дм воды, которые отбрасывают. На этой стадии можно оставить колонку на ночь при условии, что слой ионообменной смолы покрыт раствором. Дикват элюируют из колонки 50 куб. см насыщенного раствора хлорида аммония со скоростью не более 1 куб. см/мин. в мерную колбу вместимостью 50 куб. см. Раствор перемешивают.

Аликвоту раствора, полученного по п. 9.2, объемом 10 куб. см вносят с помощью медицинского шприца на концентрирующий патрон С18 Sep Pak, подготовленный по п. 7.7. Скорость прохождения раствора через патрон должна составлять 10 - 20 куб. см/мин. (время прохождения раствора через патрон 40 - 60 сек.). Первые 5 куб. см элюата отбрасывают, вторую порцию объемом 5 куб. см собирают в градуированную пробирку с пришлифованной пробкой, перемешивают и анализируют на содержание диквата по п. 9.3.

Жидкостной хроматограф с ультрафиолетовым детектором (фирмы Perkin-Elmer, США)

Колонка стальная длиной 25 см, внутренним диаметром 4 мм, содержащая Zorbax ODS, зернением 5 мкм

Температура колонки: комнатная

Скорость потока элюента: 1 куб. см/мин.

Рабочая длина волны: 310 нм

Чувствительность: 0,01 ед. абсорбции на шкалу

Объем вводимой пробы: 20 куб. мм

Ориентировочное время выхода диквата: 3,4 - 4 мин.

Линейный диапазон детектирования: 1 - 10 нг

Образцы, дающие пики большие, чем градуировочный раствор диквата с концентрацией 1,0 мкг/куб. см, разбавляют насыщенным раствором хлористого аммония.

Примечание: Ежедневно после завершения работы колонку необходимо промывать не менее 30 мин. подвижной фазой метанол - вода (1:9, по объему), затем водой. Не рекомендуется оставлять на ночь в хроматографической системе фазу, содержащую комплекс ион-парных реагентов. Ежедневно перед началом работы до ввода в инжектор градуировочного раствора хроматографируют насыщенный раствор хлорида аммония. Эту операцию рекомендуется также осуществлять в течение рабочего дня после 4-х - 5-ти вводов аналитических образцов или градуировочных растворов.

Содержание диквата в пробе рассчитывают по формуле:

где:

Х - содержание диквата в пробе, мг/кг;

А - концентрация диквата в хроматографируемом растворе, найденная по градуировочному графику в соответствии с величиной площади хроматографического пика, мкг/куб. см;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;

m - масса анализируемого образца, г.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6.2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана; Федеральный центр госсанэпиднадзора.