"МУК 4.1.2059-06. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методические указания по определению остаточных количеств прометрина в семенах и масле подсолнечника и сои, зерне и масле кукурузы, зерне гороха, клубнях картофеля и корнеплодах моркови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии"
(утв. Роспотребнадзором 10.04.2006)

1. Методические указания подготовлены Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана при участии специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко.

4. Введены впервые.

Торговое наименование: Кратер, Прометрин.

Фирма-производитель: ООО НПП Агрусхим, Агротрейд Лтд.

Действующее вещество: прометрин.

Структурная формула (не приводится).

Растворимость (г/л) при 25 °С: в воде - 0,033; этаноле - 140; н-октаноле - 110; толуоле - 200; н-гексане - 6,3; ацетоне - 300.

Стабилен к гидролизу при 20 °С в нейтральной, слегка кислой и слегка щелочной среде. Гидролизуется в теплых щелочных и кислых растворах. Разлагается под воздействием УФ-света.

Область применения: прометрин - селективный системный гербицид. Адсорбируется листьями и корнями, передается через ксилему и аккумулируется в апикальных меристемах. Ингибитор транспорта электронов в процессе фотосинтеза, а также окислительного фосфорилирования. Может использоваться для защиты хлопка, подсолнечника, орехов, картофеля, моркови, гороха и бобов.

Гигиенические нормативы: ПДК в почве - 0,5 мг/кг, ПДК в воде водоемов - 0,002 мг/куб. дм, ПДК в воздухе рабочей зоны - 5,0 мг/куб. м. МДУ для прометрина: подсолнечник (семена, масло), соя (семена, масло), кукуруза, горох - 0,1 мг/кг; морковь, картофель - 0,02 мг/кг.

2.1.1. Принцип метода

Методика основана на определении прометрина методом ВЭЖХ с использованием УФ-детектора после его извлечения из образцов водно-ацетоновой смесью или ацетонитрилом с последующей очисткой перераспределением между двумя несмешивающимися растворителями и на колонке с силикагелем.

2.1.2. Метрологическая характеристика метода

Метрологическая характеристика метода представлена в таблицах 1 и 2.

2.1.3. Избирательность метода

Присутствие других пестицидов, близких по химическому строению и области применения, определению не мешает.

Ацетон, ос.ч., ТУ 6-09-3513-86.

Ацетонитрил для ВЭЖХ, "В-230НМ".

Бумажные фильтры "красная лента", ТУ 6.091678-86.

Вода бидистиллированная, деионизированная, ГОСТ 6709-72.

Прометрин, аналитический стандарт с содержанием д.в. 99,9% (Sigma-Aldrich).

Калий углекислый, х.ч., ГОСТ 4221-76.

Калия перманганат, ГОСТ 20490-75.

Кальция хлорид, х.ч., ГОСТ 4161-77.

Кислота серная, х.ч., ГОСТ 4204-77.

Натрий двууглекислый, ГОСТ 83-79.

Натрий сернокислый безводный, ч., ГОСТ 4166-76, свежепрокаленный.

Натрия гидроксид, х.ч., ГОСТ 4328-77.

н-Гексан, х.ч., ТУ 2631-003-05807999-98, свежеперегнанный.

Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрил - вода (50:50, по объему).

Силикагель для колоночной хроматографии 60 (0,040 - 0,063 mm) (Merck, Германия).

Стекловата.

Элюент N 1 для колоночной хроматографии: смесь гексан - этилацетат (95:5, по объему).

Элюент N 2 для колоночной хроматографии: смесь гексан - этилацетат (55:45, по объему).

Этиловый эфир уксусной кислоты, ч.д.а., ГОСТ 22300-76.

Жидкостный хроматограф "Альянс" фирмы "Waters" с УФ-детектором (Waters 2487), с дегазатором и автоматическим пробоотборником или аналогичный.

Колонка Symmetry С-18 (250 х 4,6) мм, 5 мкм (Waters) и предколонка Waters Symmetry С-18.

Весы аналитические ВЛА-200, ГОСТ 34104-80Е, или аналогичные.

Гомогенизатор, МРТУ 42-1505-63.

Установка ультразвуковая "Серьга", ТУ 3.836.008.

Мельница ножевая РМ-120 и лабораторная зерновая ЛМЗ, ТУ 1-01-0593-79.

Ротационный испаритель вакуумный "Bilchi R205" (Швейцария) или аналогичный.

Бидистиллятор.

pH-метр универсальный ЭВ-74, ГОСТ 22261-76.

Насос водоструйный, МРТУ 42-861-64.

Колбы плоскодонные на шлифах КШ500 29/32 ТС, ГОСТ 10384-72.

Колбы круглодонные на шлифах КШ10 и КШ250 29-32 ТС, ГОСТ 10384-72.

Воронки лабораторные В-75-110, ГОСТ 25336-82.

Воронки делительные ВД-3-500, ГОСТ 8613-75.

Цилиндры мерные вместимостью 50, 100, 500 и 1000 куб. см, ГОСТ 1770-74.

Колбы мерные вместимостью 25, 50, 100 и 1000 куб. см, ГОСТ 1770-74.

Пипетки мерные вместимостью 1, 2, 5, 10 куб. см, ГОСТ 20292-74.

Колонки стеклянные (25 х 1) см.

Отбор проб семян и масла сои и подсолнечника проводят в соответствии с ГОСТ 10852-86 "Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб", кукурузы - по ГОСТ 13634-90 "Кукуруза. Требования при заготовке и поставке", гороха - по ГОСТ 28674-90 "Горох. Требования при заготовке и поставке", картофеля - по ГОСТ 7194-81 "Картофель свежий. Правила приемки и методы определения качества", моркови - по ГОСТ 1721-85 "Морковь столовая свежая заготовляемая и поставляемая".

2.5.1. Подготовка и очистка реактивов и растворителей

2.5.2. Кондиционирование колонки

Перед началом анализа колонку (Symmetry С-18) кондиционируют в потоке подвижной фазы (1 мл/мин.) до стабилизации нулевой линии в течение 1 - 2 часов.

2.5.3. Приготовление растворов

Для получения 50%-го водного ацетона в колбе емкостью 1 л смешивают 500 мл ацетона с 500 мл дистиллированной воды, используя мерные цилиндры. Для получения 75%-го водного ацетона в колбе емкостью 1 л смешивают 750 мл ацетона и 250 мл дистиллированной воды, используя мерные цилиндры. Для приготовления подвижной фазы смешивают ацетонитрил с водой в соотношении 50:50 по объему, используя мерные цилиндры. Для приготовления элюента N 1 в колбе на 1000 мл смешивают 950 мл н-гексана и 50 мл этилацетата. Для приготовления элюента N 2 в колбе на 1000 мл смешивают 550 мл н-гексана и 450 мл этилацетата.

Приготовление стандартного и градуировочных растворов

Берут точную навеску прометрина (50 мг), переносят в мерную колбу на 100 мл, растворяют навеску в ацетонитриле и доводят до метки. (Стандартный раствор с концентрацией 0,5 мг/мл.) Градуировочные растворы с концентрациями 0,1; 0,2; 0,5; 1,0 и 2,0 мкг/мл готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы [смесь ацетонитрил - вода (50:50, по объему)].

Стандартный раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °С в течение 1 месяца, градуировочные растворы - в течение суток.

При изучении полноты извлечения прометрина из проб семян подсолнечника и сои, зерна кукурузы и гороха, клубней картофеля и корнеплодов моркови используют ацетонитрильные растворы вещества. Растворы внесения с концентрациями 0,1 и 1,0 мкг/мл готовят из стандартного раствора с концентрацией 0,5 мг/мл методом последовательного разбавления по объему ацетонитрилом. При изучении полноты извлечения прометрина из проб масла используют растворы вещества в изопропиловом спирте. Растворы внесения с концентрациями 0,1 и 1,0 мкг/мл готовят из стандартного раствора с концентрацией 0,5 мг/мл методом последовательного разбавления по объему изопропанолом.

2.5.4. Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика (площадь пика - концентрация прометрина в растворе) в хроматограф вводят по 50 мкл градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций), измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации прометрина в градуировочном растворе (мкг/мл).

2.5.5. Подготовка колонки с силикагелем для очистки экстракта

В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 1 см помещают тампон из стекловаты, закрывают кран и вносят суспензию 5 г силикагеля в 30 мл смеси гексан - этилацетат (95:5, по объему). Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента. Колонку последовательно промывают 30 мл элюента N 2 и 30 мл элюента N 1 со скоростью 1 - 2 капли в секунду, после чего она готова к работе.

2.5.6. Проверка хроматографического поведения прометрина на колонке с силикагелем

В круглодонную колбу емкостью 10 мл отбирают 0,1 мл стандартного раствора прометрина с концентрацией 10 мкг/мл. Отдувают растворитель током теплого воздуха (температура не выше 40 °С), остаток растворяют в 5 мл элюента N 1 и наносят на колонку. Колбу обмывают еще 5 мл элюента N 1 и также вносят на колонку. Промывают колонку 25 мл элюента N 1, которые отбрасывают, затем 80 мл элюента N 2 со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 10 мл каждая, упаривают, остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 2.5.3) и анализируют на содержание прометрина по п. 2.6.5.

Фракции, содержащие прометрин, объединяют, упаривают досуха, остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и вновь анализируют по п. 2.6.5. Рассчитывают содержание прометрина в элюате, определяя полноту вымывания вещества из колонки и необходимый для этого объем элюента.

Примечание: параметры удерживания прометрина и сопутствующих экстрактивных веществ могут меняться при использовании новой партии сорбента и растворителей.

2.5.7. Подготовка приборов и средств измерения

Установка и подготовка всех приборов и средств измерения проводится в соответствии с требованиями технической документации.

2.6.1. Извлечение прометрина из семян подсолнечника, зерна сои, кукурузы и гороха

Навеску размолотых на лабораторной мельнице семян или зерна подсолнечника, сои, кукурузы, гороха массой 20 г помещают в коническую колбу емкостью 250 мл, приливают 50 мл ацетонитрила и экстрагируют в течение 15 мин. на ультразвуковой ванне. Суспензию фильтруют на стеклянной воронке через бумажный фильтр "красная лента". Осадок с фильтра количественно переносят назад в колбу и экстракцию повторяют дважды с 50 мл ацетонитрила. Объединенные экстракты помещают в делительную воронку объемом 500 мл, добавляют 50 мл дистиллированной воды и промывают трижды гексаном порциями по 30 мл, встряхивая смесь каждый раз в течение 2 - 3 мин. и отбрасывая верхний гексановый слой. Экстракт выпаривают до водного остатка (~45 - 50 мл) на роторном испарителе при температуре не выше 40 °С. Водный остаток фильтруют на стеклянной воронке через бумажный фильтр "красная лента". Раствор помещают в делительную воронку объемом 250 мл и экстрагируют прометрин гексаном трижды порциями по 30 мл, встряхивая смесь каждый раз в течение 2 - 3 мин. и собирая верхний гексановый слой. Объединенный экстракт пропускают через слой безводного сульфата натрия (2 г), осушитель промывают 10 - 15 мл гексана. После этого экстракт выпаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °С. Дальнейшую очистку экстракта проводят по пункту 2.6.4.

2.6.2. Извлечение прометрина из проб масла сои, кукурузы и подсолнечника

Образец масла сои, кукурузы или подсолнечника массой 20 г растворяют в 50 мл гексана, помещают в делительную воронку емкостью 250 мл и экстрагируют прометрин ацетонитрилом трижды порциями по 50 мл, встряхивая смесь каждый раз в течение 2 - 3 мин. и собирая нижний ацетонитрильный слой. Объединенные экстракты помещают в делительную воронку объемом 500 мл, добавляют 50 мл дистиллированной воды и промывают трижды гексаном порциями по 30 мл, встряхивая смесь каждый раз в течение 2 - 3 мин. и отбрасывая верхний гексановый слой. Экстракт фильтруют на стеклянной воронке через бумажный фильтр "красная лента". Экстракт выпаривают до водного остатка (~45 - 50 мл) на роторном испарителе при температуре не выше 40 °С. Водный остаток фильтруют на стеклянной воронке через бумажный фильтр "красная лента". Раствор помещают в делительную воронку объемом 250 мл и экстрагируют прометрин гексаном трижды порциями по 30 мл, встряхивая смесь каждый раз в течение 2 - 3 мин. и собирая верхний гексановый слой. Объединенный экстракт пропускают через слой безводного сульфата натрия (2 г), осушитель промывают 10 - 15 мл гексана. После этого экстракт выпаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °С. Дальнейшую очистку экстракта проводят по пункту 2.6.4.

2.6.3. Извлечение прометрина из проб клубней картофеля и корнеплодов моркови

Гомогенизированные пробы корнеплодов моркови или клубней картофеля массой 20 г помещают в коническую колбу емкостью 250 мл и экстрагируют прометрин 50 мл 50%-ного водного ацетона на ультразвуковой установке в течение 15 мин. Суспензию фильтруют через бумажный фильтр "красная лента". Осадок с фильтра количественно переносят назад в колбу. Экстракцию проводят еще дважды. Объединенный экстракт выпаривают на ротационном испарителе при температуре бани не выше 40 °С до полного удаления ацетона. Объем экстракта доводят до 75 мл и фильтруют через бумажный фильтр "красная лента". Раствор помещают в делительную воронку объемом 250 мл и экстрагируют прометрин гексаном трижды порциями по 30 мл, встряхивая смесь каждый раз в течение 2 - 3 мин. и собирая верхний гексановый слой. Объединенный экстракт пропускают через слой безводного сульфата натрия (2 г), осушитель промывают 10 - 15 мл гексана. После этого экстракт выпаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °С. Дальнейшую очистку экстракта проводят по пункту 2.6.4.

Внимание! Отделение водного слоя следует производить только после полного расслоения жидкостей в делительной воронке.

В случае образования сравнительно стойких эмульсий для сокращения времени расслоения можно добавить в делительную воронку на стадии переэкстракции из водного раствора в гексан насыщенный раствор хлорида натрия (15 - 20 мл).

2.6.4. Очистка на колонке с силикагелем

Сухой остаток в колбе, полученный при выпаривании очищенных по п. 2.6.1 - 2.6.3 экстрактов растительных материалов и масла, количественно переносят двумя 5 мл порциями смеси гексан - этилацетат (95:5, по объему) в кондиционированную хроматографическую колонку (п. 2.5.5). Промывают колонку 25 мл элюента N 1. Элюат отбрасывают. Прометрин элюируют 75 мл элюента N 2, собирая элюат в грушевидную колбу емкостью 250 мл. Раствор упаривают досуха на вакуумном ротационном испарителе при температуре не выше 40 °С. Сухой остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и 50 мкл раствора вводят в жидкостный хроматограф.

2.6.5. Условия хроматографирования

Жидкостный хроматограф "Альянс" фирмы Waters с УФ-детектором (Waters 2487) или другой с аналогичными характеристиками.

Рабочая длина волны 260 нм. Предколонка Waters Symmetry С-18 для защиты аналитической колонки. Колонка Symmetry С-18 (250 х 4,6) мм, 5 мкм (Waters, USA).

Подвижная фаза: ацетонитрил - вода в соотношении 50:50. Скорость потока 1 мл/мин.

Время удерживания прометрина 10,7 +/- 0,2 мин. Объем вводимой пробы 50 мкл.

Линейный диапазон детектирования 0,1 - 2,0 мкг/мл.

2.6.6. Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом абсолютной градуировки, содержание прометрина в анализируемых образцах (Х, мг/кг) вычисляют по формуле:

Содержание остаточных количеств прометрина в анализируемом образце вычисляют как среднее из 3-х параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор прометрина 2 мкг/мл, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

При проведении работы необходимо соблюдать общепринятые правила безопасности при работе в химических лабораториях, а также инструкции по эксплуатации жидкостного хроматографа и других используемых приборов.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости результатов измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

ВНИИ защиты растений.