"МУК 4.1.2083-06. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методические указания по определению остаточных количеств тиаметоксама в семенах и масле подсолнечника методом высокоэффективной жидкостной хроматографии"
(утв. Роспотребнадзором 30.07.2006)

1. Методические указания подготовлены Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана при участии специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко.

4. Введены впервые.

Настоящие Методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации тиаметоксама в семенах и масле подсолнечника в диапазоне 0,02 - 0,2 и 0,05 - 0,5 мг/кг, соответственно.

Тиаметоксам - действующее вещество инсектицида Круйзер, СК (350 г/л), фирма-производитель Сингента Кроп Протекшн АГ (Швейцария).

3-(2-хлор-тиазол-5-илметил)-5-метил-[1,3,5]оксадиазинан-4-илиден-N-нитроамин (ИЮПАК).

3-[(2-хлор-5-тиазолил)метил]тетрагидро-5-метил-N-нитро-4Н-1,3,5-оксадиазин-4-имин (С.А.).

Структурная формула (не приводится).

Инсектицид нетоксичен для птиц, дафний, земляных червей, почвенных микроорганизмов и токсичен для пчел.

Гигиенические нормативы для тиаметоксама в России: ПДК в почве - 0,2 мг/кг; ПДК в воде - 0,1 мг/куб. дм; ОБУВ в воздухе рабочей зоны - 0,4 мг/куб. м; МДУ для зерна хлебных злаков, картофеля, огурцов и гороха - 0,05 мг/кг, баклажанов, перца и томатов - 0,2 мг/кг, яблок и груш - 0,1 мг/кг.

Область применения препарата

Тиаметоксам является системным инсектицидом. Он воздействует на никотиново-ацетилхолиновый рецептор нервной системы насекомых, обладает быстрой желудочной и контактной активностью. Вещество проявляет высокую эффективность против сосущих, грызущих и почвенных насекомых на овощных, зерновых и цветочных культурах, фруктовых и цитрусовых деревьях, хлопчатнике и рисе.

Проходит регистрационные испытания в России и странах СНГ под торговым названием Круйзер, СК (350 г тиаметоксама в 1 л препарата). Препарат предназначен для борьбы с почвенными и грызущими насекомыми на посевах подсолнечника, рапса, горчицы и сахарной свеклы путем предпосевной обработки семян при норме расхода препарата до 14 л/т семян.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в таблице 2.

Методика основана на определении тиаметоксама с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовым детектором. Контроль тиаметоксама в образцах семян и масла подсолнечника осуществляется по содержанию вещества после экстракции его из матриц ацетонитрилом при ультразвуковой обработке, очистки экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей, а также на колонке с силикагелем и концентрирующем патроне Диапак С8.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичной или более высокой квалификацией.

Допускается применение другого оборудования с аналогичными или лучшими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими веществами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостной хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя с опытом работы на жидкостном хроматографе.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией "лаборант", имеющего опыт работы в химической лаборатории.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 + 5) °С и относительной влажности не более 80%.

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление растворов, подвижной фазы для ВЭЖХ, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики, подготовка колонки с силикагелем и концентрирующего патрона Диапак С8.

7.1.1. Очистка ацетонитрила

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора не менее 1 часа, после чего перегоняют. Непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия.

7.1.2. Очистка н-гексана

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до прекращения окрашивания ее в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над поташом.

7.1.3. Очистка этилацетата

Этилацетат промывают последовательно 5%-ным водным раствором карбоната натрия, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над безводным карбонатом калия и перегоняют.

7.1.4. Очистка силикагеля

Силикагель 60 (0,063 - 0,20 мм) для колоночной хроматографии встряхивают с двойным объемом очищенного ацетона и затем фильтруют на воронке Бюхнера через бумажный фильтр. Силикагель на фильтре промывают 1,5 объемом ацетона и затем высушивают при температуре 130 °С в течение 5 часов.

Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 8 - 10 мм уплотняют тампоном из стекловаты, медленно выливают в колонку (при открытом кране) суспензию 5 г силикагеля I степени активности в 20 куб. см гексана. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку промывают 20 куб. см ацетона и 30 куб. см смеси гексан - ацетон (9:1, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в сек., после чего она готова к работе.

Концентрирующий патрон Диапак С8 промывают последовательно с помощью медицинского шприца 10 куб. см ацетонитрила и 10 куб. см смеси ацетонитрил - вода (5:95, по объему) со скоростью 5 куб. см/мин.

В круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 0,1 куб. см градуировочного раствора N 1 тиаметоксама с концентрацией 10 мкг/куб. см в метаноле (п. 7.6.2), раствор упаривают досуха, остаток растворяют в 3 куб. см смеси гексан - ацетон (9:1, по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на колонку, подготовленную по п. 7.2. Промывают колонку 40 куб. см смеси гексан - ацетон (1:1, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в сек., элюат отбрасывают. Затем колонку промывают 40 куб. см смеси гексан - ацетон (4:6, по объему). Фракционно (по 10 куб. см) отбирают элюат, упаривают, остатки растворяют в 1 куб. см метанола, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., вносят 3,5 куб. см подвижной фазы, подготовленной по п. 7.4, перемешивают и анализируют на содержание тиаметоксама по п. 9.5.

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 330 куб. см метанола, 670 куб. см бидистиллированной воды, перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр.

Промывают колонку подвижной фазой (приготовленной по п. 7.4) при скорости подачи растворителя 1 куб. см/мин. не менее 2-х часов до установления стабильной базовой линии.

7.6.1. Исходный раствор тиаметоксама для градуировки (концентрация 100 мкг/куб. см). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 0,010 г тиаметоксама, растворяют в 40 - 50 куб. см метанола, доводят метанолом до метки, тщательно перемешивают.

Раствор хранят в морозильной камере при температуре не выше -18 °С в течение 3-х месяцев.

7.6.2. Раствор тиаметоксама N 1 для градуировки (концентрация 2 мкг/куб. см).

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 2 куб. см исходного раствора тиаметоксама с концентрацией 100 мкг/куб. см (п. 7.6.1), разбавляют метанолом до метки. Этот раствор используют для приготовления рабочих градуировочных растворов N 2 - 5.

Для приготовления проб семян и масла с внесением при оценке полноты извлечения тиаметоксама из исследуемых образцов используют изопропанольный раствор тиаметоксама с концентрацией 1 мкг/куб. см.

Градуировочный раствор N 1 хранят в морозильной камере при температуре не выше -18 °С в течение месяца.

7.6.3. Рабочие растворы N 2 - 5 тиаметоксама для градуировки (концентрация 0,02 - 0,2 мкг/куб. см).

В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают 1,0, 2,0, 5,0 и 10,0 куб. см градуировочного раствора N 1 тиаметоксама с концентрацией 2 мкг/куб. см (п. 7.6.2), доводят до метки подвижной фазой, приготовленной по п. 7.4, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 2 - 5 с концентрацией тиаметоксама 0,02, 0,04, 0,1 и 0,2 мкг/куб. см, соответственно.

Растворы готовят непосредственно перед использованием.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость высоты пика (мм) от концентрации тиаметоксама в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4-м растворам для градуировки.

В инжектор хроматографа вводят по 20 куб. мм каждого градуировочного раствора (п. 7.6.3) и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.5. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79) и правилами, определенными ГОСТом 10852-86 "Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб".

Пробы семян высушивают до стандартной влажности и хранят в матерчатых или бумажных мешочках при температуре 4 °С. Масло хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике при температуре не выше 4 °С. В некоторых случаях масло получают из семян подсолнечника экстракцией органическими неполярными растворителями (петролейный и диэтиловый эфиры) непосредственно перед проведением анализа. Перед анализом семена размалывают на мельнице.

9.1.1. Семена. Навеску (10 г) размолотых семян подсолнечника помещают в коническую колбу вместимостью 250 куб. см, приливают 100 куб. см ацетонитрила и помещают в ультразвуковую ванну на 5 минут. Раствор (с осадком) фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр. Осадок на фильтре промывают 50 куб. см ацетонитрила. Экстракт и промывную жидкость переносят в химический стакан, перемешивают, измеряют объем раствора и 1/4 его часть (эквивалентна 2,5 г образца) переносят в делительную воронку вместимостью 100 куб. см. Дальнейшую очистку экстракта проводят по пп. 9.2, 9.3 и 9.4.

9.1.2. Масло. Навеску масла (5 г) помещают в делительную воронку вместимостью 100 куб. см, приливают 30 куб. см ацетонитрила и смесь интенсивно встряхивают в течение 2-х минут. После полного разделения фаз верхнюю ацетонитрильную фракцию отделяют и собирают в химический стакан вместимостью 100 куб. см. Операцию экстракции масла повторяют, используя 30 куб. см ацетонитрила. Измеряют объем объединенной ацетонитрильной фракции и 1/5 ее часть (эквивалентна 1 г образца) переносят в делительную воронку вместимостью 100 куб. см. Дальнейшую очистку экстракта проводят по пп. 9.2, 9.3 и 9.4.

К экстракту, полученному по пп. 9.1.1 и 9.1.2 и помещенному в делительную воронку, приливают 20 куб. см гексана и смесь встряхивают в течение 1 минуты. После разделения фаз верхний гексановый слой отбрасывают, а нижнюю ацетонитрильную фракцию собирают в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. К ацетонитрильному экстракту прибавляют 20 куб. см деионизованной воды, перемешивают и раствор упаривают на ротационном вакуумном испарителе до водного остатка (15 - 20 куб. см) при температуре не выше 40 °С. К водному остатку прибавляют 10 куб. см насыщенного раствора хлорида натрия, перемешивают и переносят в делительную воронку вместимостью 100 куб. см. В воронку вносят 30 куб. см хлористого метилена, интенсивно встряхивают в течение 2-х минут. После разделения фаз нижний органический слой фильтруют через слой безводного сульфата натрия в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. Операцию экстракции водной фазы повторяют еще два раза, используя по 15 куб. см хлористого метилена. Объединенную органическую фазу, пропущенную через слой безводного сульфата натрия, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре 30°С и подвергают дополнительной очистке на колонке с силикагелем и концентрирующем патроне Диапак С8 по пп. 9.3 и 9.4.

Сухой остаток круглодонной колбе, полученный по 9.2, растворяют в 0,5 куб. см ацетона, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., добавляют 2,5 куб. см гексана, перемешивают, вновь помещают в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на колонку, подготовленную по п. 7.2. Колбу обмывают 5 куб. см смеси гексан - ацетон (1:1, по объему), которые также наносят на колонку. Колонку промывают 35 куб. см смеси гексан - ацетон (1:1, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в сек., элюат отбрасывают. Таметоксам элюируют с колонки 35 куб. см смеси гексан - ацетон (4:6, по объему), собирая элюат непосредственно в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. Раствор упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре 30 °С.

Сухой остаток в круглодонной колбе, полученный по п. 9.3, растворяют в 0,2 куб. см ацетонитрила, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., добавляют 2,8 куб. см деионизованной воды, перемешивают, вновь помещают в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на концентрирующий патрон Диапак С8, подготовленный по п. 7.2, элюат отбрасывают. Колонку промывают 7 куб. см смеси ацетонитрил - вода (5:95, по объему), элюат отбрасывают. Тиаметоксам элюируют с патрона 3 куб. см смеси ацетонитрил - вода (2:8, по объему), собирая элюат непосредственно в круглодонную колбу. Раствор упаривают досуха при температуре не выше 40 °С. Остаток в колбе растворяют в 1 куб. см метанола, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., вносят 1,5 куб. см подвижной фазы, подготовленной по п. 7.3, перемешивают и анализируют на содержание тиаметоксама по п. 9.5.

Жидкостный хроматограф с ультрафиолетовым детектором (фирма Knauer, Германия)

Колонка стальная длиной 15 см, внутренним диаметром 4 мм, содержащая в качестве неподвижной фазы Диасфер 110-С18, зернением 5 мкм

Температура колонки: комнатная

Подвижная фаза: метанол - вода (33:67, по объему)

Скорость потока элюента: 0,7 мл/мин.

Рабочая длина волны: 255 нм

Чувствительность: 0,005 ед. абсорбции на шкалу

Объем вводимой пробы: 20 куб. мм

Время удерживания тиаметоксама: около 5 минут

Линейный диапазон детектирования 0,4 - 4 нг

Альтернативная неподвижная фаза: Диасорб 130-С8 Т (6 мкм)

Время удерживания тиаметоксама: около 4 мин. 40 сек.

Образцы, дающие пики большие чем стандартный раствор с концентрацией 0,2 мкг/куб. см, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

Содержание тиаметоксама рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе "менее нижней границы определения" менее 0,02 мг/кг <*> для семян и менее 0,05 мг/кг <**> для масла.

--------------------------------

<*> 0,02 мг/кг - предел обнаружения для семян.

<**> 0,05 мг/кг - предел обнаружения для масла.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

ВНИИ фитопатологии.