"МУК 4.1.2108-06. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение массовой концентрации фенола в биосредах (кровь) газохроматографическим методом. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 09.08.2006)

Методические указания по определению концентраций химических веществ в биологических средах предназначены для использования Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, лечебными и научными учреждениями, работающими в области профпатологии и экологии человека, научно-исследовательскими институтами, занимающимися вопросами гигиены окружающей среды.

Методические указания разработаны с целью обеспечения контроля за содержанием органических соединений в биологических средах у населения, проживающего в районах с повышенным уровнем загрязнения окружающей среды.

Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ Р 8.563-96 "ГСОЕИ. Методики выполнения измерений", ГОСТ Р 1.5-92 "ГСС. Общие требования к построению, изложению, оформлению и содержанию стандартов". Методика анализа обеспечивает выполнение измерений массовой концентрации фенола в крови в диапазоне концентраций: от 0,04 до 0,50 мкг/куб. см с погрешностью 24,8% при доверительной вероятности 0,95.

Методика основана на предварительном переводе фенола в метилфениловый эфир в щелочной среде с помощью йодистого метила, концентрировании продукта дериватизации из крови экстракцией диэтиловым эфиром и последующем газохроматографическом анализе экстракта. Необходимость превращения фенола в производные вызвана тем, что прямой газохроматографический анализ фенолов, особенно следовых количеств, осложнен высокой полярностью фенольных соединений и низким давлением их паров. Улучшить газохроматографические свойства фенола можно путем превращения их в менее полярные соединения.

Выполнение измерений массовой концентрации фенола проводят методом газовой хроматографии с использованием пламенно-ионизационного детектора. Определению не мешают о-, м-, п-крезолы, ксиленолы в количествах, не превышающих верхнюю границу измеряемой концентрации фенола. Длительность анализа, включая экстракцию пробы, - 20 мин.

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, материалы, реактивы и растворы. Допускается применение других типов средств измерений, вспомогательного оборудования и химреактивов с аналогичными или лучшими метрологическими и техническими характеристиками.

4.1. При выполнении работ должны быть соблюдены меры противопожарной безопасности в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.004-85 и правила техники безопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.007-76.

4.2. При работе необходимо соблюдать "Правила по технике безопасности и производственной санитарии при работе в химических лабораториях" (утверждены МЗ СССР 20.12.82) и "Правила устройства и безопасной эксплуатации сосудов, работающих под давлением" (утверждены Госгортехнадзором СССР 27.11.87).

4.3. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.005-88.

4.4. При выполнении измерений с использованием газового хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцией по эксплуатации прибора.

К выполнению измерений допускаются лица, имеющие квалификацию не ниже инженера-химика и опыт работы на газовом хроматографе и в химической лаборатории, прошедшие соответствующий инструктаж, освоившие метод в процессе тренировки и уложившиеся в нормативы оперативного контроля при выполнении процедур контроля погрешности.

6.1. При проведении процессов приготовления растворов и подготовки проб к анализу соблюдают следующие условия:

- температура воздуха (20 +/- 5) °С;

- атмосферное давление 630 - 800 мм рт. ст.;

- влажность воздуха не более 80% при температуре 25 °С.

6.2. Выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендуемых технической документацией по прибору.

Перед выполнением измерений проводят следующие работы: подготовка посуды, подготовка хроматографической колонки, приготовление аттестованных смесей, установление градуировочной характеристики.

Используемую посуду замочить на 1 ч в свежеприготовленном 3%-м растворе дихромата калия в серной кислоте (3 г дихромата калия на 100 куб. см концентрированной серной кислоты), отмыть в проточной водопроводной воде, ополоснуть дистиллированной водой и просушить при температуре 120 °С.

Хроматографическую колонку перед заполнением неподвижной фазой промывают дистиллированной водой, ацетоном и высушивают в токе инертного газа. Заполнение хроматографической колонки насадкой проводят под вакуумом. Концы колонки закрывают стекловатой, устанавливают в хроматограф и, не подключая к детектору, кондиционируют в токе газа-носителя (гелий) с расходом 30 куб. см/мин. при температуре 250 °С в течение 18 ч. После охлаждения колонку подключают к детектору, записывают нулевую линию в рабочем режиме. При отсутствии мешающих влияний колонка готова к работе.

Для построения градуировочного графика собирают кровь, не содержащую исследуемых компонентов, и готовят серию рабочих аттестованных растворов.

Исходный аттестованный раствор фенола. В мерную колбу объемом 25 куб. см, содержащую ацетон в объеме 15 куб. см, вводят 10 мг фенола, и объем доводят до метки ацетоном. Весовое содержание определяемого вещества в исходном аттестованном растворе составляет 400 мкг/куб. см. Срок хранения - 5 ч.

Исходный аттестованный раствор нафталина (внутренний стандарт). В мерную колбу объемом 25 куб. см, содержащую ацетон в объеме 15 куб. см, вводят 10 мг нафталина и объем доводят до метки ацетоном. Весовое содержание определяемого вещества в исходном аттестованном растворе составляет 400 мкг/куб. см. Срок хранения - 3 дня.

Определение градуировочных коэффициентов. 50 куб. см рабочего аттестованного раствора помещают в делительную воронку объемом 250 куб. см и добавляют 2 г кристаллического карбоната натрия. Плавным покачиванием перемешивают содержимое воронки, затем вводят в воронку 0,3 куб. см йодистого метила и встряхивают в течение 5 мин. для перевода фенола в метилфениловый эфир.

Продукт метилирования экстрагируют 10 куб. см диэтилового эфира в течение 10 мин. Подготовленные пробы - экстракты центрифугируют для денатурации белка в течение 10 мин., затем помещают в бюксу и упаривают под ИК-лампой до 1 куб. см.

В хроматографическую колонку через испаритель вводят по 10 куб. мм каждого экстракта рабочего аттестованного раствора и анализируют в условиях:

Отбор проб венозной крови в объеме не менее 10 куб. см производится в тщательно вымытую стеклянную пробирку с притертой пробкой, в которую предварительно добавлено 0,1 куб. см раствора гепарина. Анализ крови проводить сразу или хранить в морозильной камере не более 5 дней.

Пробу крови объемом 2 куб. см доводят до 50 куб. см бидистиллированной водой и помещают в делительную воронку объемом 250 куб. см, добавляют внутренний стандарт - нафталин 0,1 куб. см. Затем добавляют 2 г кристаллического карбоната натрия. Плавным покачиванием перемешивают содержимое воронки, затем вводят в воронку 0,3 куб. см йодистого метила и встряхивают в течение 5 мин. для перевода фенола в метилфениловый эфир.

Продукт метилирования экстрагируют 10 куб. см диэтилового эфира в течение 10 мин. Подготовленную пробу - экстракт центрифугируют для денатурации белка в течение 10 мин., затем помещают в бюксу и упаривают под ИК-лампой до 1 куб. см. Полученный экстракт хроматографируют и проводят количественное определение анализируемого соединения в подготовленной пробе методом внутреннего стандарта. Процедуру повторяют аналогично для второго образца и проводят выполнение измерений двух параллельных проб крови. Условия выполнения измерений аналогичные, как при установлении градуировочной характеристики (п. 7.5).

На хроматограмме рассчитывают площади пиков метилфенилового эфира и внутреннего стандарта (нафталина).

Внутренний контроль качества (ВКК) результатов измерений - повторяемость, внутрилабораторная прецизионность (воспроизводимость), точность - осуществляют с целью получения оперативной информации о качестве измерений и принятия при необходимости оперативных мер по его повышению в соответствии с нормативным документом МИ 2335-2003 "ГСОЕИ. Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа".

Методика выполнения измерений обеспечивает получение результатов измерений с погрешностью, не превышающей значений, приведенных в табл. 2 и 3.

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят раз в квартал в анализируемой серии измерений. Определяют содержание исследуемых соединений в градуировочных растворах, которые соответствуют началу, середине и концу градуировочного интервала. Градуировка признается стабильной, если расхождение между заданным и измеренным значением концентраций не превышает 5%.

Если условие не выполняется, эксперимент повторяют. При повторном получении отрицательного результата выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.

Внутренний контроль качества воспроизводимости проводят с использованием рабочей пробы. Пробу делят на две равные части и анализируют в соответствии с методикой, максимально варьируя условия проведения анализа (разные операторы, разное время, разные партии реактивов одного типа, разные наборы мерной посуды и т.д.). Воспроизводимость результатов контрольных измерений признают удовлетворительной, если выполняется условие:

Если условие не выполняется, эксперимент повторяют. При повторном получении отрицательного результата выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.

При превышении оперативного контроля погрешности эксперимент повторяют. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам контроля, устраняют их и процедуру контроля повторяют.

Периодичность ВКК регламентируют согласно руководству по качеству лаборатории.

1. Бандман А.Л., Войтенко Г.А., Волкова Н.В. и др. Вредные химические вещества. Углеводороды. Галогенпроизводные углеводородов: Справ. изд./Под ред. В.А. Филова и др. Л.: "Химия", 1990.

Методические указания разработаны Пермским научно-исследовательским клиническим институтом детской экопатологии (Т.С. Уланова, Т.В. Нурисламова, Н.А. Попова).