"МУК 4.1.2055-06. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методические указания по определению остаточных количеств флудиоксонила в зерне и масле сои методом высокоэффективной жидкостной хроматографии"
(утв. Роспотребнадзором 10.04.2006)

1. Методические указания подготовлены Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана при участии специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко.

4. Введены впервые.

Настоящие Методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации флудиоксонила в зерне и масле сои в диапазоне 0,02 - 0,2 мг/кг.

Флудиоксонил - действующее вещество фунгицида Максим, КС (25 г/л), фирма-производитель Сингента Кроп Протекшн АГ (Швейцария).

4-(2,2-дифтор-1,3-бензодиоксол-4-ил)-пиррол-3-карбонитрил (IUPAC).

Структурная формула (не приводится).

Рекомендуемый норматив для флудиоксонила в зерне и масле сои - 0,02 мг/кг.

Область применения препарата

Флудиоксонил - контактный фунгицид широкого спектра действия с продолжительной активностью. Высокоэффективен против снежной плесени, твердой головни, гельминтоспориозной и фузариозной корневых гнилей на зерновых злаках, а также ризоктониоза, склеротиниоза, серой гнили и альтернариоза на винограде, косточковых плодовых, овощных и декоративных культурах.

Зарегистрирован в России под торговым названием Максим, КС (25 г/л) в качестве фунгицида для предпосевного протравливания семян зерновых культур, гороха, а также для обработки клубней картофеля перед закладкой на хранение. В настоящее время проходит регистрационные испытания в качестве протравителя семян сои.

Метрологические характеристики метода представлены в таблицах 1 и 2.

Методика основана на определении вещества с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовым детектором. Контроль флудиоксонила в матрицах осуществляется по содержанию вещества после экстракции его из зерна и масла ацетонитрилом, очистки экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей, а также на колонке с оксидом алюминия.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичной или более высокой квалификацией.

Допускается применение другого оборудования с аналогичными или лучшими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостной хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на жидкостном хроматографе.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией "лаборант", имеющего опыт работы в химической лаборатории.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °С и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление растворов, подвижной фазы для ВЭЖХ, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики, подготовка колонки с оксидом алюминия.

7.1.1. Очистка н-гексана

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до прекращения ее окрашивания в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над поташом.

7.1.2. Очистка этилацетата

Этилацетат промывают последовательно 5%-ным водным раствором карбоната натрия, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над безводным карбонатом калия и перегоняют.

7.1.3. Очистка диэтилового эфира

Растворитель предварительно встряхивают со свежеприготовленным раствором железного купороса, а затем последовательно промывают 0,5%-ным раствором перманганата калия, 5%-ным раствором гидроксида натрия и водой, после чего сушат над хлористым кальцием и перегоняют.

Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 8 - 10 мм уплотняют тампоном из стекловаты, медленно выливают в колонку (при открытом кране) суспензию: 10 г оксида алюминия V степени активности в 20 куб. см гексана (оксид алюминия V степени активности по Брокману получают добавлением 15% воды к оксиду алюминия I степени активности). Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку промывают 20 куб. см смеси гексан - этилацетат (8:2, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в сек., после чего она готова к работе.

В круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 0,5 куб. см градуировочного раствора N 1 флудиоксонила с концентрацией 10 мкг/куб. см в ацетонитриле (п. 7.6.2), раствор упаривают досуха, остаток растворяют в 0,6 куб. см этилацетата, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., добавляют 2,4 куб. см гексана, перемешивают, вновь помещают в ультразвуковую баню на 1 мин. Раствор наносят на колонку, подготовленную по п. 7.2. Промывают колонку 50 куб. см смеси гексан - этилацетат (8:2, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в сек. Фракционно (по 5 куб. см) отбирают элюат, упаривают, остатки растворяют в 1 куб. см ацетонитрила, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., вносят 1 куб. см подвижной фазы, подготовленной по п. 7.4, перемешивают и анализируют на содержание флудиоксонила по п. 9.4.

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 500 куб. см ацетонитрила, 500 куб. см бидистиллированной воды, перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр.

Промывают колонку подвижной фазой (приготовленной по п. 7.4) при скорости подачи растворителя 1 куб. см/мин. не менее 2-х часов до установления стабильной базовой линии.

7.6.1. Исходный раствор флудиоксонила для градуировки (концентрация 100 мкг/куб. см)

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 0,010 г флудиоксонила, растворяют в 40 - 50 куб. см ацетонитрила, доводят ацетонитрилом до метки, тщательно перемешивают.

Раствор хранят в морозильной камере при температуре не выше -18 °С в течение 3-х месяцев.

7.6.2. Раствор флудиоксонила N 1 для градуировки (концентрация 10 мкг/куб. см)

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 10 куб. см исходного раствора флудиоксонила с концентрацией 100 мкг/куб. см (п. 7.6.1), разбавляют ацетонитрилом до метки. Этот раствор используют для приготовления рабочих градуировочных растворов N 2 - 5.

Для приготовления проб зерна и масла с внесением при оценке полноты извлечения флудиоксонила из исследуемых образцов используют ацетоновый раствор флудиоксонила с концентрацией 10 мкг/куб. см.

Градуировочный раствор N 1 и ацетоновый раствор флудиоксонила хранят в морозильной камере при температуре не выше -18 °С в течение месяца.

7.6.3. Рабочие растворы N 2 - 5 флудиоксонила для градуировки (концентрация 0,05 - 0,5 мкг/куб. см)

В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают 0,5; 1,0; 2,5 и 5,0 куб. см градуировочного раствора N 1 флудиоксонила с концентрацией 10 мкг/куб. см (п. 7.6.2), доводят до метки подвижной фазой, приготовленной по п. 7.4, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 2 - 5 с концентрацией флудиоксонила 0,05; 0,1; 0,25 и 0,5 мкг/куб. см соответственно.

Растворы готовят непосредственно перед использованием.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость высоты пика (мм) от концентрации флудиоксонила в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4-м растворам для градуировки.

В инжектор хроматографа вводят по 20 куб. мм каждого градуировочного раствора (п. 7.6.3) и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.4. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений.

Отбор проб производится в соответствии с правилами, определенными ГОСТом 10852-86 "Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб".

Пробы зерна высушивают до стандартной влажности и хранят в холодильнике при температуре не выше 4 °С. Масло хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике при температуре не выше 4 °С. В некоторых случаях масло получают из зерна сои экстракцией органическими неполярными растворителями (петролейный и диэтиловый эфиры) непосредственно перед проведением анализа.

9.1.1. Зерно. Образец размолотого зерна массой 10 г помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 куб. см, добавляют 100 куб. см ацетонитрила и помещают в ультразвуковую ванну на 5 мин. Раствор (с осадком) фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу вместимостью 250 куб. см. Осадок на фильтре промывают 25 куб. см ацетонитрила. Экстракт и промывную жидкость, объединенные в мерном цилиндре, перемешивают, измеряют объем раствора и 1/2 его часть (эквивалентную 5 г образца) переносят в круглодонную колбу. Далее проводят очистку экстракта по п. 9.2.

9.1.2. Масло. Образец масла массой 5 г вносят в делительную воронку вместимостью 100 куб. см, добавляют 10 куб. см гексана, перемешивают. В воронку вносят 30 куб. см ацетонитрила, интенсивно встряхивают воронку в течение 2-х мин. После полного разделения фаз нижний ацетонитрильный слой отделяют и собирают в химический стакан вместимостью 100 куб. см. Операцию экстракции масляной фазы повторяют еще дважды, используя по 20 куб. см ацетонитрила. Дальнейшую очистку объединенного ацетонитрильного экстракта проводят по п. 9.2.

Экстракты, полученные по пп. 9.1.1 и 9.1.2, переносят в делительную воронку вместимостью 200 куб. см, прибавляют 20 куб. см гексана и воронку интенсивно встряхивают в течение 2-х мин. После разделения фаз нижний ацетонитрильный слой переносят в круглодонную колбу и упаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре 40 °С. Остаток в круглодонной колбе растворяют в 20 куб. см смеси ацетонитрил - вода (3:7, по объему) и переносят в делительную воронку вместимостью 100 куб. см. В воронку вносят 20 куб. см смеси гексан - диэтиловый эфир (4:1, по объему), интенсивно встряхивают воронку в течение 2-х мин. После разделения фаз верхний органический слой отделяют, фильтруют через слой безводного сульфата натрия, помещенный на бумажный фильтр в конусной воронке, в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. Операцию экстракции водно-ацетонитрильной фазы повторяют еще дважды, используя по 15 куб. см смеси гексан - диэтиловый эфир (4:1, по объему). Объединенную органическую фазу, пропущенную через слой сульфата натрия, упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 30 °С.

Сухой остаток в круглодонной колбе, полученный по п. 9.2, растворяют в 0,6 куб. см этилацетата, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., добавляют 2,4 куб. см гексана, перемешивают, вновь помещают в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на колонку, подготовленную по п. 7.2. Колбу обмывают 3 куб. см смеси гексан - этилацетат (8:2, по объему), которые также наносят на колонку. Промывают колонку 35 куб. см смеси гексан - этилацетат (8:2, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в сек., отбрасывают первые 10 куб. см элюата и собирают последующие 25 куб. см в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. Раствор упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 40 °С. Остаток в колбе растворяют в 1 куб. см ацетонитрила, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., вносят 1 куб. см подвижной фазы, подготовленной по п. 7.4, перемешивают и анализируют на содержание флудиоксонила по п. 9.4.

Жидкостной хроматограф с ультрафиолетовым детектором (фирмы Knauer, Германия)

Колонка стальная длиной 15 см, внутренним диаметром 4 мм, содержащая Кромасил 100-С18 (5 мкм)

Температура колонки: комнатная

Подвижная фаза: ацетонитрил - вода (50:50, по объему)

Скорость потока элюента: 0,8 куб. см/мин.

Рабочая длина волны: 268 нм

Чувствительность: 0,005 ед. абсорбции на шкалу

Объем вводимой пробы: 20 куб. мм

Ориентировочное время выхода флудиоксонила: 10,5 - 11 мин.

Линейный диапазон детектирования: 1 - 10 нг

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор с концентрацией 0,5 мкг/куб. см, разбавляют подвижной фазой, приготовленной по п. 7.4

Альтернативная подвижная фаза: Диасорб 130-С16

Ориентировочное время выхода флудиоксонила: 9,6 - 10,3 мин.

Содержание флудиоксонила рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6.2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

ВНИИ фитопатологии.