"МУК 4.1.2013-05. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методические указания по определению остаточных количеств тетраметрина в мясе, печени, жире и молоке сельскохозяйственных животных методом высокоэффективной жидкостной хроматографии"
(утв. Роспотребнадзором 17.10.2005)

1. Подготовлены Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана при участии специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко.

4. Введены впервые.

Настоящие Методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения в мясе, печени, жире и молоке сельскохозяйственных животных массовых концентраций тетраметрина в диапазоне 0,1 - 2,0 мг/кг.

Тетраметрин - действующее вещество ветеринарного препарата НЕОСТОМАЗАН 55 г/л (д.в. тетраметрин 50 г/л + циперметрин 5 г/л), фирма-производитель "Сева Санте Анималь" (Франция).

(1RS,3RS;1RS,3RS)-2,2-диметил-3-(2-метилпроп-1-енил)циклопропанкарбоновой кислоты циклогекс-1-ен-1,2-дикарбоксимидометиловый эфир (IUPAC).

Структурная формула (не приводится).

Область применения препарата

Тетраметрин - инсектицид класса пиретроидов.

Препарат Неостомазан 55 г/л (д.в. циперметрин 50 г/л + тетраметрин 5 г/л) рекомендуется для борьбы с эктопаразитами (мухами, вшами, блохами, иксодовыми клещами) животных - крупного рогатого скота, овец, лошадей, а также для лечения и профилактики псороптоза, демадекоза и чесотки.

Рекомендуемые МДУ тетраметрина в мышцах, печени, почках, жире, молоке - 0,2 мг/кг.

Метрологические характеристики метода представлены в таблицах 1 и 2.

Методика основана на определении вещества с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовым детектором (УФ) после экстракции из анализируемой пробы ацетонитрилом, очистки экстракта перераспределением между двумя несмешивающимися фазами и на колонке с флорисилом.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

Нижний предел измерения в хроматографируемом объеме пробы - 50 нг.

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичной или более высокой квалификацией.

Допускается применение хроматографических колонок и другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на жидкостном хроматографе.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией "лаборант", имеющего опыт работы в химической лаборатории.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °С и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление градуировочных растворов и раствора внесения, установление градуировочной характеристики, подготовка колонки с флорисилом для очистки экстракта, проверка хроматографического поведения вещества на колонке.

7.1.1. Очистка ацетонитрила

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора не менее 1 часа, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия.

7.1.2. Очистка н-гексана и хлористого метилена

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до тех пор, пока она не перестанет окрашиваться в желтый цвет, водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над поташом.

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помешают 680 куб. см ацетонитрила, 320 куб. см деионизированной воды, перемешивают, фильтруют и дегазируют.

Промывают колонку подвижной фазой (приготовленной по п. 7.2) при скорости подачи растворителя 1,5 куб. см/мин. до установления стабильной базовой линии.

7.4.1. Исходный раствор тетраметрина (концентрация 500 мкг/куб. см)

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 0,05 г тетраметрина, растворяют в 50 - 70 куб. см метанола, доводят метанолом до метки, тщательно перемешивают. Раствор хранится в холодильнике в течение 3-х месяцев.

Растворы N 1 - 5 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходного раствора.

7.4.2. Рабочие растворы N 1 - 5 тетраметрина (концентрация 2,5 - 50,0 мкг/куб. см)

В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают по 1,0; 2,0; 5,0 и 10,0 куб. см исходного раствора с концентрацией 500 мкг/куб. см (п. 7.4.1), доводят до метки ацетонитрилом, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 2 - 5 с концентрацией тетраметрина 5; 10; 25 и 50 мкг/куб. см соответственно.

Для приготовления раствора N 1 с концентрацией тетраметрина 2,5 мкг/куб. см в мерную колбу вместимостью 50 куб. см помещают 1,0 куб. см исходного раствора с концентрацией 500 мкг/куб. см (п. 7.4.1), доводят до метки ацетонитрилом, тщательно перемешивают.

Растворы хранятся в холодильнике не более месяца.

Рабочие растворы используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения тетраметрина из исследуемых образцов.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади (высоты) пика от концентрации тетраметрина в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 5-ти растворам для градуировки N 1 - 5.

В инжектор хроматографа вводят по 20 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.4. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений.

Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см, внутренним диаметром 8 - 10 мм уплотняют тампоном из стекловаты, насыпают 5 г флорисила, медленно наливают в колонку (при открытом кране) 15 - 20 куб. см гексана. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонка готова к работе.

В круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 1 куб. см рабочего раствора N 5 с концентрацией тетраметрина 50 мкг/куб. см (п. 7.4.2), растворитель упаривают досуха, остаток растворяют в 5 куб. см гексана и наносят на колонку, подготовленную по п. 7.6. Колбу обмывают трижды порциями гексана по 3 куб. см, которые также наносят на колонку. Промывают колонку 50 куб. см гексана, элюат отбрасывают.

Затем колонку промывают 120 куб. см смеси гексан - диэтиловый эфир (8:2, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в сек. Фракционно (по 10 куб. см) отбирают элюат, упаривают, остатки растворяют в 1 куб. см ацетонитрила, анализируют по п. 9.4.

Фракции, содержащие тетраметрин, объединяют и вновь анализируют.

Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с колонки и необходимый объем элюента.

Примечание: Проверку хроматографического поведения тетраметрина следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии сорбентов и растворителей.

Отбор продуктов питания осуществляется в соответствии с требованиями ГОСТов на исследуемые продукты: ГОСТ 7269-79 "Мясо", ГОСТ 3622-68 "Молоко и молочные продукты".

Обобранные образцы продуктов герметично упаковывают в полиэтиленовые мешки, стеклянные банки с притертыми крышками. Образцы анализируют непосредственно после отбора проб или хранят в морозильной камере при -18 °С.

Непосредственно перед анализом образцы размораживают, пробы органов и тканей массой 200 - 300 г тщательно измельчают с использованием гомогенизатора. Пробу гомогенизированного образца мяса печени и жира, а также молока массой 50 г взвешивают на аналитических весах в плоскодонных колбах вместимостью 250 куб. см.

К пробе гомогенизированного образца органов животных, а также молока массой 50 г, помещенной в колбу вместимостью 250 куб. см, приливают 100 куб. см ацетонитрила, тщательно перемешивают путем встряхивания в течение 5 мин., выдерживают на ультразвуковой бане 1 мин., затем на встряхивателе 30 мин. и помещают на 12 - 15 часов в холодильник (4 - 6 °С).

Надосадочную жидкость осторожно переносят в круглодонную колбу вместимостью 250 куб. см, фильтруя ее через тампон из стекловаты, помещенный в конусную химическую воронку.

Для более полного разделения фаз эмульсионный слой пробы молока переносят в центрифужные стаканы и центрифугируют при 3000 об./мин. в течение 5 мин., затем отделившийся раствор объединяют с первой порцией надосадочной жидкости в круглодонной колбе.

Раствор упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не более 40 °С до объема 40 - 50 куб. см (приблизительно в 2 раза), внимательно следя за процессом, не допуская вспенивания и переброса жидкости, затем очищают перераспределением по п. 9.2.

Сконцентрированный раствор, полученный по п. 9.1, переносят в делительную воронку вместимостью 250 куб. см, вносят в нее 150 куб. см деионизованной воды, 5 куб. см насыщенного раствора хлористого натрия и 50 куб. см смеси гексан - диэтиловый эфир (1:1, по объему), интенсивно встряхивают в течение 2-х мин. После полного разделения фаз нижний слой возвращают в круглодонную колбу, верхний фильтруют через 2-см слой сульфата натрия (помещенный в конусную химическую воронку на бумажном фильтре) в круглодонную колбу вместимостью 250 куб. см. Водную фазу переносят в делительную воронку и операцию экстракции повторяют новой порцией смеси гексан - диэтиловый эфир (1:1, по объему) объемом 50 куб. см.

Профильтрованный объединенный экстракт упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 20 куб. см ацетонитрила, насыщенного гексаном, и переносят в делительную воронку вместимостью 150 куб. см, добавляют 20 куб. см гексана, интенсивно встряхивают в течение 1 мин. Разделившиеся фазы переносят в отдельные конические колбы. Нижний ацетонитрильный слой возвращают в делительную воронку, вносят новую порцию гексана объемом 20 куб. см и операцию экстракции повторяют. Затем нижний ацетонитрильный слой переносят в круглодонную колбу вместимостью 150 куб. см, к оставшемуся в воронке гексану приливают ранее отделенный гексановый слой, вносят 10 куб. см ацетонитрила, насыщенного гексаном, встряхивают 1 мин. После разделения фаз нижний ацетонитрильный слой объединяют с первым экстрактом, помещенным в круглодонную колбу, упаривают досуха и подвергают дополнительной очистке на колонке по п. 9.3.

Остаток, полученный по п. 9.2, находящийся в круглодонной колбе, растворяют в 5 куб. см гексана и наносят на колонку, подготовленную по п. 7.6. Колбу обмывают трижды порциями гексана по 3 куб. см, которые также наносят на колонку. Промывают колонку 50 куб. см гексана, элюат отбрасывают.

Тетраметрин элюируют с колонки 100 куб. см смеси гексан - диэтиловый эфир (8:2, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в сек., собирая элюат в круглодонную колбу. Раствор упаривают досуха при температуре не выше 40 °С, остаток в колбе растворяют в 2 куб. см ацетонитрила и анализируют содержание тетраметрина по п. 9.4.

Измерения выполняют при следующих режимных параметрах:

Колонка стальная длиной 25 см, внутренним диаметром 4,0 мм, содержащая Кромасил 100 С18, зернением 8 мкм.

Температура колонки: комнатная.

Подвижная фаза: ацетонитрил - вода (680:320, по объему).

Скорость потока элюента: 1,5 куб. см/мин.

Рабочая длина волны: 280 нм.

Чувствительность: 0,01 ед. абсорбции на шкалу.

Объем вводимой пробы: 20 куб. мм.

Ориентировочное время выхода тетраметрина: 10,3 - 10,5 мин.

Образцы, дающие пики большие, чем градуировочный раствор тетраметрина с концентрацией 50 мкг/куб. см, разбавляют ацетонитрилом.

Содержание тетраметрина в пробе (Х, мг/кг) рассчитывают по формуле:

где:

А - концентрация тетраметрина, найденная по градуировочному графику, мкг/куб. см;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;

m - масса анализируемого образца, г.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана (ФНЦГ им. Ф.Ф. Эрисмана).