"МУК 4.1.1954-05. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методические указания по определению остаточных количеств этилентиомочевины в картофеле, огурцах, томатах, томатном соке, луке, винограде и виноградном соке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии"
(утв. Роспотребнадзором 18.01.2005)

1. Методические указания подготовлены Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана при участии специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко.

4. Введены впервые.

Настоящие Методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации этилентиомочевины в картофеле, огурцах, томатах и томатном соке в диапазоне 0,002 - 0,04 мг/кг, луке, винограде и виноградном соке в диапазоне 0,004 - 0,04 мг/кг.

Этилентиомочевина - продукт метаболизма пестицида класса этиленбисдитиокарбаматов манкоцеба - действующего вещества препарата МЕТАКСИЛ, СП (640 г/кг манкоцеба + 80 г/кг металаксила), производитель ЗАО Фирма "Август" (Россия).

Этилентиомочевина (ЭТМ) - имидазолидин-2-тион (IUPAC).

Белое кристаллическое вещество без запаха. Температура плавления: 203 - 204 °С. Практически нерастворима в ацетоне, диэтиловом эфире, хлороформе, бензоле, керосине, умеренно растворима в метаноле, этаноле, уксусной кислоте, этиленгликоле, пиридине. Растворимость в воде - 20 г/куб. дм (25 °С); 90 г/куб. дм (60 °С), 440 г/куб. дм (90 °С).

Гигиенические нормативы:

ДСД - 0,001 мг/кг массы тела.

МДУ во всех растительных и пищевых продуктах - 0,02 мг/кг.

Область применения препарата

Препарат МЕТАКСИЛ, СП (640 г/кг манкоцеба + 80 г/кг металаксила) рекомендуется в качестве фунгицида на виноградной лозе, картофеле, огурцах, томатах открытого грунта, луке.

Метрологические характеристики метода представлены в таблицах 1 и 2.

--------------------------------

<*> При соотношении сигнал/шум, равном 5.

Методика основана на определении вещества с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовым детектором после экстракции из анализируемых проб метанолом, очистки экстракта на колонке с оксидом алюминия.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

В предлагаемых условиях определения метод специфичен в присутствии пестицидов, применяемых в интенсивной технологии выращивания лука, винограда, огурцов, томатов, картофеля.

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Допускается применение другого оборудования и хроматографических колонок с аналогичными техническими характеристиками, обеспечивающими аналогичное разделение.

4.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1.005).

4.2. При выполнении измерений с использованием газового и жидкостного хроматографов соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТом 12.1.019 и инструкцией по эксплуатации прибора.

К выполнению измерений допускают лиц, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на жидкостном хроматографе.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят согласно ГОСТу 15150 при температуре воздуха (20 +/- 5) °С, атмосферном давлении 630 - 800 мм рт. ст. и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей, подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ, кондиционирование хроматографической колонки, приготовление градуировочных растворов, построение градуировочной характеристики, подготовка колонки для очистки экстракта, проверка хроматографического поведения вещества на колонке с оксидом алюминия.

Метилен хлористый последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до тех пор, пока она не перестанет окрашиваться в желтый цвет, далее водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над поташом. Хранят над безводным сульфатом натрия.

Метанол подвергают перегонке при атмосферном давлении с дефлегматором.

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 990 куб. см бидистиллированной воды, добавляют 10 куб. см метанола, перемешивают, фильтруют и дегазируют.

Промывают колонку подвижной фазой для ВЭЖХ со скоростью подачи растворителя 0,3 куб. см/мин. (анализ по п. 9.3.1) или 1 куб. см/мин. (анализ по п. 9.3.2) до установления стабильной базовой линии.

7.4.1. Исследование проб лука, винограда и виноградного сока

7.4.1.1. Исходный раствор для градуировки (концентрация 1 мг/куб. см)

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 0,1 г ЭТМ, доводят до метки бидистиллированной водой, тщательно перемешивают.

Исходный раствор хранится в холодильнике в течение 3-х месяцев в плотно закрытой посуде.

Растворы N 1 - 6 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходного раствора.

7.4.1.2. Раствор N 1 для градуировки (концентрация 10 мкг/куб. см). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 1 куб. см исходного раствора для градуировки с концентрацией 1 мг/куб. см, доводят до метки бидистиллированной водой, тщательно перемешивают. Раствор хранится в холодильнике в течение месяца.

Этот раствор используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения ЭТМ из исследуемых образцов.

7.4.1.3. Раствор N 2 для градуировки (концентрация 1 мкг/куб. см). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 10 куб. см раствора N 1 для градуировки с концентрацией 10 мкг/куб. см, доводят до метки бидистиллированной водой, тщательно перемешивают. Раствор хранится в холодильнике в течение месяца.

7.4.1.4. Рабочие растворы N 3 - 6 для градуировки (соответствуют концентрациям 0,01 - 0,1 мкг/куб. см).

В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают с помощью пипетки по 1; 2; 5 и 10 куб. см раствора N 2 с концентрацией 1 мкг/куб. см (п. 7.4.1.3), доводят до метки бидистиллированной водой, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы ЭТМ N 3 - 6 с концентрациями 0,01; 0,02; 0,05 и 0,1 мкг/куб. см соответственно.

Растворы хранятся в холодильнике в течение недели.

7.4.2. Исследование проб картофеля, огурцов, томатов и томатного сока

7.4.2.1. Исходный раствор для градуировки (концентрация 100 мкг/куб. см)

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 0,01 г ЭТМ, доводят до метки метанолом, тщательно перемешивают.

Исходный раствор хранится в морозильной камере при -12 °С не более 15 дней.

7.4.2.2. Раствор N 1а для градуировки (концентрация 5 мкг/куб. см)

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 5 куб. см исходного раствора для градуировки с концентрацией 100 мкг/куб. см (п. 7.4.2.1), доводят до метки подвижной фазой для ВЭЖХ (п. 7.2).

7.4.2.3. Рабочие растворы N 2а - 5а для градуировки (соответствуют концентрациям 0,025 - 0,5 мкг/куб. см).

В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают с помощью пипетки по 0,5; 2,5; 5 и 10 куб. см раствора N 1 с концентрацией 5 мкг/куб. см (п. 7.4.2.2), доводят до метки подвижной фазой для ВЭЖХ (п. 7.2), тщательно перемешивают, получают рабочие растворы ЭТМ N 2а - 5а с концентрациями 0,025; 0,125; 0,25 и 0,5 мкг/куб. см соответственно.

Растворы хранятся в холодильнике не более суток.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (отн. единицы) от концентрации ЭТМ в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4-м растворам для градуировки N 3 - 6 или 2а - 5а.

В инжектор хроматографа вводят по 20 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.3.1 или 9.3.2. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений.

Оксид алюминия, помещенный на воронку Бюхнера, промывают трижды порциями метанола, равными объему сорбента, сушат разряжением, создаваемым водоструйным насосом, затем активируют в сушильном шкафу при 140 - 150 °С в течение 15-ти часов, охлаждают в эксикаторе.

При исследовании проб лука, винограда и виноградного сока нижнюю часть стеклянной колонки длиной 35 - 40 см, внутренним диаметром 13 - 15 мм уплотняют тампоном из стекловаты, медленно выливают в колонку (при открытом кране) суспензию 20 г оксида алюминия в 30 - 35 куб. см хлористого метилена. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента. После этого колонка готова к работе.

При исследовании проб картофеля, огурцов, томатов и томатного сока используют суспензию 7,5 г оксида алюминия в 20 куб. см дихлорметана, а также колонку длиной 30 см.

7.7.1. Лук, виноград и виноградный сок

В круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 0,5 куб. см раствора N 2 для градуировки (п. 7.4.1.3), добавляют 8 куб. см метанола, перемешивают и наносят на колонку, подготовленную по п. 7.6. Промывают колонку 100 куб. см смеси хлористый метилен - метанол (19:1, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в сек. Фракционно (по 10 куб. см) отбирают элюат, упаривают, остатки растворяют в 5-ти куб. см бидистиллированной воды, анализируют на содержание ЭТМ по п. 9.3.1.

7.7.2. Картофель, огурцы, томаты и томатный сок

В круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 0,05 куб. см исходного раствора с концентрацией ЭТМ 100 мкг/куб. см в метаноле (п. 7.4.2.1), удаляют растворитель слабым потоком чистого сжатого воздуха или инертного газа, остаток количественно переносят тремя порциями (1,5 + 1,5 + 2 куб. см) водного метанола (150 мг воды в 5 куб. см метанола) на колонку, подготовленную по п. 7.6. Промывают колонку 90 куб. см смеси хлористый метилен - метанол (19:1, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в сек. Фракционно (по 6 куб. см) отбирают элюат, упаривают, остатки растворяют в 1 - 2-х куб. см подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 7.2), анализируют на содержание ЭТМ по п. 9.3.2.

Фракции, содержащие ЭТМ, объединяют и вновь анализируют.

Рассчитывают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с колонки и необходимый для очистки объем элюента.

ПРИМЕЧАНИЕ: Проверку хроматографического поведения ЭТМ следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии сорбентов и растворителей.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов", утвержденными заместителем Главного государственного санитарного врача СССР 21.08.79, N 2051-79.

Отобранные пробы лука, винограда и виноградного сока анализируют в день отбора или хранят при 4 °С в течение 10-ти дней, срок хранения образцов огурцов, томатов, картофеля - не более недели.

Для длительного хранения пробы замораживают и хранят при температуре -18 °С. Непосредственно перед анализом образцы лука и винограда измельчают на гомогенизаторе, огурцов, томатов, картофеля - при помощи терки для овощей.

9.1.1. Лук, виноград, виноградный сок

Образец измельченного лука, ягод винограда или виноградного сока массой 20 г помещают в коническую колбу вместимостью 200 - 250 куб. см, вносят 100 куб. см метанола. Колбы с образцами лука и ягод винограда встряхивают на механическом встряхивателе в течение 45-ти минут. Образец виноградного сока помещают на 2 часа в холодильник (4 - 6 °С).

Затем растворы фильтруют на воронке Бюхнера через двойной бумажный фильтр "красная лента" под вакуумом. Осадок на фильтре промывают дважды по 20 куб. см метанола. Экстракт и промывку переносят в мерный цилиндр вместимостью 200 куб. см с пришлифованной пробкой, перемешивают, измеряют объем раствора, 1/2 его часть (эквивалентную 10 г образца) переносят в круглодонную колбу и упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 45 °С до получения малоподвижной вязкой массы. Колбу с остатком отсоединяют от роторного испарителя. Оставшиеся капли конденсата выше уровня исходного фильтрата (около шлифа грушевидной колбы) удаляют с помощью фильтровальной бумаги. Для более полного освобождения от летучих продуктов содержимое колбы продувают слабой струей сжатого воздуха в течение 10 - 15 мин.

Далее проводят очистку экстракта по п. 9.2.1.

9.1.2. Картофель, огурцы, томаты, томатный сок

Образец измельченных огурцов, картофеля, томатов или томатного сока массой 25 г помещают в коническую колбу вместимостью 200 - 250 куб. см, вносят 50 куб. см метанола. Содержимое колбы интенсивно перемешивают в течение 30-ти минут на магнитной мешалке. Полученный экстракт переносят на фильтр Шота, присоединенный через переходник к грушевидной колбе вместимостью 200 куб. см, и фильтруют с помощью водоструйного насоса. Осадок растительного материала на фильтре промывают 25 куб. см метанола, фильтруя промывной раствор в ту же грушевидную колбу. Фильтрат упаривают при температуре не выше 60 °С до получения малоподвижной (томаты, томатный сок) или практически не текучей (огурцы, картофель) вязкой массы. Колбу с остатком отсоединяют от роторного испарителя. Оставшиеся капли конденсата выше уровня исходного фильтрата (около шлифа грушевидной колбы) удаляют с помощью фильтровальной бумаги. Для более полного освобождения от летучих продуктов содержимое колбы продувают слабой струей сжатого воздуха или инертного газа в течение 20 - 30 мин.

9.2.1. Лук, виноград, виноградный сок

Высушенный экстракт, полученный по п. 9.1.1, растворяют при перемешивании и температуре 38 - 42 °С в 2 куб. см метанола и 0,5 куб. см бидистиллированной воды, помещая колбу на ультразвуковую баню. Затем в колбу вносят порциями по 2 куб. см еще 6 куб. см метанола. После прибавления последней порции колбу закрывают пришлифованной пробкой и помещают на ультразвуковую баню на 2 - 3 мин.

Полученный водно-метанольный раствор переносят в подготовленную по п. 7.3 колонку, дают растворителю стечь до верхнего края сорбента. ЭТМ элюируют с колонки 70 куб. см смеси хлористый метилен - метанол (19:1, по объему), собирая элюат в круглодонную колбу вместимостью 150 куб. см. Раствор упаривают при температуре не выше 45 °С почти досуха, затем продувают слабой струей сжатого воздуха досуха. Остаток растворяют в 4 куб. см бидистиллированной воды, помещая колбу на ультразвуковую баню. Раствор фильтруют при помощи набора для фильтрации проб (или через плотный тампон из стекловаты, помещенный в конусную воронку) и анализируют на содержание ЭТМ по п. 9.3.

9.2.2. Огурцы, томаты, томатный сок, картофель

Высушенный экстракт, полученный по п. 9.1.2, растворяют при медленном перемешивании и температуре 38 - 42 °С в 1 куб. см метанола и строго определенного количества бидистиллированной воды, помещая колбу на ультразвуковую баню. Количество добавляемой воды составляет 145, 150 и 350 куб. мм соответственно для огурцов, томатов (томатного сока) и картофеля. Операция растворения высушенного экстракта занимает достаточно длительное время (от одного до 2-х часов). Затем в колбу вносят порциями по 1 куб. см еще 4 куб. см метанола. После прибавления каждой порции метанола содержимое колбы осторожно перемешивают, после прибавления последней порции колбу закрывают пришлифованной пробкой и помещают на ультразвуковую баню на 10 мин.

Полученный водно-метанольный раствор переносят в подготовленную по п. 7.3 колонку, дают растворителю стечь до верхнего края сорбента. ЭТМ элюируют с колонки 60 куб. см смеси хлористый метилен - метанол (19:1, по объему), собирая элюат в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. Раствор упаривают при температуре не выше 50 °С почти досуха, затем продувают слабой струей сжатого воздуха или инертного газа досуха. Остаток растворяют в 2 куб. см бидистиллированной воды, помещая колбу на ультразвуковую баню. Раствор фильтруют при помощи набора для фильтрации проб (или через плотный тампон из стекловаты, помещенный в конусную воронку) и анализируют на содержание ЭТМ по п. 9.3.

9.3.1. Лук, виноград, виноградный сок

Хроматограф жидкостной с ультрафиолетовым детектором (Perkin-Elmer, США)

Колонка хроматографическая стальная длиной 25 см, внутренним диаметром 2 мм, содержащая Spherisorb S5 ODS 2, зернением 5 мкм

Температура колонки: комнатная

Скорость потока элюента: 0,3 куб. см/мин.

Рабочая длина волны: 233 нм

Чувствительность: 0,02 ед. абсорбции на шкалу

Объем вводимой пробы: 20 мкл

Подвижная фаза: вода - метанол (99:1, по объему)

Ориентировочное время выхода ЭТМ: 4,6 - 4,9 мин.

Линейный диапазон детектирования: 0,2 - 2,0 нг

Образцы, дающие пики большие, чем градуировочные растворы с концентрацией 0,1 мкг/куб. см, разбавляют бидистиллированной водой.

9.3.2. Огурцы, томаты, томатный сок, картофель

Хроматограф жидкостной с ультрафиолетовым детектором, модель 1100 (Agilent Technologies, США)

Колонка хроматографическая стальная длиной 25 см, внутренним диаметром 4,6 мм, содержащая Zorbax SB С18, зернением 5 мкм

Температура термостата колонки: 25 °С

Скорость потока элюента: 1 куб. см/мин.

Рабочая длина волны: 233 нм

Чувствительность: 0,007 ед. абсорбции на шкалу

Объем вводимой пробы: 50 мкл

Подвижная фаза: вода - метанол (99:1, по объему)

Ориентировочное время выхода ЭТМ: 4,5 мин.

Линейный диапазон детектирования 0,5 - 10 нг

Образцы, дающие пики большие, чем градуировочные растворы с концентрацией 0,5 мкг/куб. см, разбавляют подвижной фазой (п. 7.2).

Содержание ЭТМ в пробе рассчитывают по формуле:

где:

Х - содержание ЭТМ в пробе, мг/кг;

А - концентрация ЭТМ, найденная по градуировочному графику, мкг/куб. см;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;

m - масса анализируемого образца, г.

К - коэффициент пересчета, учитывающий объем экстрактов проб, используемый для анализа, равный для лука, винограда и виноградного сока - 2, для огурцов, томатов, томатного сока, картофеля - 1.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6.2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана, Федеральный центр Госсанэпиднадзора - лук, виноград, виноградный сок.

ЗАО Фирма "Август" - огурцы, томаты, томатный сок, картофель.