"МУК 4.1.2084-06. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методические указания по определению остаточных количеств тебуконазола в семенах, масле и зеленой массе рапса методом капиллярной газожидкостной хроматографии"
(утв. Роспотребнадзором 30.07.2006)

1. Методические указания подготовлены Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана при участии специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко.

4. Введены впервые.

Настоящие Методические указания устанавливают метод капиллярной газожидкостной хроматографии для определения массовой концентрации тебуконазола в семенах, масле и зеленой массе рапса в диапазоне 0,1 - 1,0 мг/кг.

Тебуконазол - действующее вещество фунгицида Фоликур, КЭ (250 г/л), фирма-производитель Байер Кроп Сайенс (Германия).

(RS)-1-п-хлорфенил-4,4-диметил-3-(1Н-1,2,4-триазол-1-илметил)пентан-3-ол (ИЮПАК)

(+/-)-альфа-[2-(4-хлорфенил)этил]-альфа-(1,1-диметилэтил)-1Н-1,2,4-триазол-1-этанол (С.А.).

Структурная формула (не приводится).

Вещество устойчиво к гидролизу при pH 5 - 9 и фотолизу.

Тебуконазол медленно разрушается в почве и слабо передвигается по почвенному профилю.

Краткая токсикологическая характеристика

Фунгицид нетоксичен для птиц, пчел, дождевых червей и водорослей.

Рекомендуемый норматив для тебуконазола в семенах и масле рапса - 0,2 мг/кг.

Область применения препарата

Тебуконазол - системный фунгицид широкого спектра действия с защитным, лечебным и искореняющим эффектом. Эффективен против возбудителей мучнистой росы, ржавчины, септориоза, фузариоза, ринхоспориоза на зерновых злаках, альтернариоза и склеротиниоза на рапсе. Используется как для обработки вегетирующих растений, так и для протравливания семян.

Зарегистрирован в России под торговым названием Фоликур, КЭ (250 г/л) в качестве фунгицида для обработки вегетирующих растений зерновых злаков и рапса.

Метрологические характеристики метода представлены в таблицах 1 и 2.

Методика основана на определении вещества с помощью капиллярной газожидкостной хроматографии (ГЖХ) с термоионным детектором (ТИД). Контроль тебуконазола в матрицах осуществляется по содержанию вещества после экстракции его из зеленой массы водным ацетоном, из семян и масла ацетонитрилом, очистки экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей, а также на колонке с силикагелем.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Тебуконазол, аналитический стандарт фирмы Байер (Германия) с содержанием д.в. 99,8%.

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичной или более высокой квалификацией.

Допускается применение другого оборудования с аналогичными или лучшими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя с опытом работы на газовом хроматографе.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией "лаборант", имеющего опыт работы в химической лаборатории.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 + 5) °С и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики, подготовка колонки с силикагелем.

7.1.1. Очистка н-гексана

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до прекращения окрашивания последней в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над поташом.

7.1.2. Очистка этилацетата

Этилацетат промывают последовательно 5%-ным водным раствором карбоната натрия, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над безводным карбонатом калия и перегоняют.

7.1.3. Очистка ацетона

7.1.4. Очистка силикагеля

Силикагель I степени активности встряхивают с двойным объемом очищенного ацетона и затем фильтруют на воронке Бюхнера через бумажный фильтр. Силикагель на фильтре промывают 1,5 объемом ацетона и затем высушивают при температуре 130 °С в течение 3 часов.

Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 8 - 10 мм уплотняют тампоном из стекловаты, медленно выливают в колонку (при открытом кране) суспензию 3 г силикагеля I степени активности в 15 куб. см гексана. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку промывают 20 куб. см гексана со скоростью 1 - 2 капли в сек., после чего она готова к работе.

В круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 0,1 куб. см градуировочного раствора N 1 тебуконазола с концентрацией 10 мкг/куб. см в этилацетате (п. 7.5.2). Отдувают растворитель током теплого воздуха, остаток растворяют в 3 куб. см этилацетата, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на колонку с силикагелем, подготовленную по п. 7.2. Промывают колонку 50 куб. см смеси гексан:этилацетат (1:1, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в сек., элюат отбрасывают. Затем колонку с силикагелем промывают 60 куб. см смеси гексан:этилацетат (2:8, по объему). Фракционно (по 10 куб. см) отбирают элюат, упаривают, остатки растворяют в 1 см этилацетата, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., и анализируют на содержание тебуконазола по п. 9.4.

Капиллярную кварцевую колонку ZB-1 (типа SE-30) устанавливают в термостат хроматографа и, не подсоединяя к детектору, кондиционируют при температуре 280 °С и скорости газа-носителя 2 куб. см/мин. в течение 8 - 10 часов.

7.5.1. Исходный раствор тебуконазола для градуировки (концентрация 100 мкг/куб. см). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 0,010 г тебуконазола, растворяют в 40 - 50 куб. см этилацетата, доводят этилацетатом до метки, тщательно перемешивают.

Раствор хранят в морозильной камере при температуре не выше -18 °С в течение 3-х месяцев.

7.5.2. Раствор тебуконазола N 1 для градуировки (концентрация 10 мкг/кую. см).

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 10 куб. см исходного раствора тебуконазола с концентрацией 100 мкг/куб. см (п. 7.5.1), разбавляют этилацетатом до метки. Этот раствор используют для приготовления рабочих градуировочных растворов N 2 - 5.

Для приготовления проб семян и зеленой массы с внесением при оценке полноты извлечения тебуконазола из исследуемых образцов используют ацетоновый раствор тебуконазола с концентрацией 10 мкг/куб. см, а для приготовления проб масла - раствор тебуконазола в изопропаноле с концентрацией 10 мкг/куб. см.

Градуировочный раствор N 1, а также ацетоновый и изопропанольный растворы тебуконазола хранят в морозильной камере при температуре не выше -18 °С в течение месяца.

7.5.3. Рабочие растворы N 2 - 5 тебуконазола для градуировки (концентрация 0,2 - 2,0 мкг/куб. см).

В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают 2,0; 4,0; 10,0 и 20,0 куб. см градуировочного раствора N 1 тебуконазола с концентрацией 10 мкг/куб. см (п. 7.5.2), доводят до метки этилацетатом, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 2 - 5 с концентрацией тебуконазола 0,2; 0,4; 1,0 и 2,0 мкг/куб. см соответственно. Растворы готовят непосредственно перед использованием.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость высоты пика (мВ) от концентрации тебуконазола в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки.

В инжектор хроматографа вводят по 1 куб. мм каждого градуировочного раствора (п. 7.5.3) и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.4. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений.

Отбор проб производится в соответствии с правилами, определенными ГОСТом 10852-86 "Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб".

Пробы зеленой массы хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике не более одного дня; для длительного хранения пробы замораживают и хранят при температуре -18 °С до анализа. Пробы семян высушивают до стандартной влажности и хранят в холодильнике при температуре не выше 4 °С. Масло хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике при температуре не выше 4 °С. В некоторых случаях масло получают из семян рапса экстракцией органическими неполярными растворителями (петролейный и диэтиловый эфиры) непосредственно перед проведением анализа.

9.1.1. Зеленая масса. Образец измельченного растительного материала массой 20 г помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 куб. см, добавляют 100 куб. см смеси ацетон:вода (7:3, по объему) и суспензию перемешивают в течение 1 часа на аппарате для встряхивания. Суспензию фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу вместимостью 250 куб. см. Осадок на фильтре промывают 50 куб. см смеси ацетон:вода (7:3, по объему). Экстракт и промывную жидкость переносят в химический стакан, перемешивают, измеряют объем раствора и 1/4 его часть (эквивалентную 5 г образца) переносят в круглодонную колбу. Далее проводят очистку экстракта по п. 9.2.

9.1.2. Семена. Образец размолотых семян массой 10 г помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 куб. см, добавляют 50 куб. см ацетонитрила и помещают на аппарат для встряхивания на 1 час. Суспензию фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу вместимостью 250 куб. см. Осадок на фильтре промывают 30 куб. см ацетонитрила. Экстракт и промывную жидкость переносят в химический стакан, перемешивают, измеряют объем раствора и 1/2 его часть (эквивалентную 5 г образца) переносят в делительную воронку вместимостью 100 куб. см. В воронку вносят 10 куб. см гексана, интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После разделения фаз нижний ацетонитрильный слой фильтруют в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см через слой ваты, помещенный в конусную воронку. Вату на фильтре промывают 10 куб. см ацетонитрила, которые объединяют с фильтратом. Объединенную ацетонитрильную фракцию упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре 40 °С и подвергают очистке на колонке по п. 9.3.

9.1.3. Масло. К образцу масла массой 5 г, помещенного в плоскодонную колбу вместимостью 250 куб. см, добавляют 50 куб. см ацетонитрила и колбу помещают на встряхиватель на 30 мин. Верхний ацетонитрильный слой декантируют в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см через слой ваты, помещенной в конусную воронку. К оставшемуся в колбе маслу приливают 25 куб. см ацетонитрила и операцию экстракции повторяют. После декантации ацетонитрильного слоя вату промывают 10 куб. см ацетонитрила, которые объединяют с фильтратом. Объединенную ацетонитрильную фазу, пропущенную через вату, переносят в делительную воронку вместимостью 250 куб. см, добавляют 15 куб. см гексана и воронку интенсивно встряхивают в течение 2-х мин. После полного разделения фаз нижний ацетонитрильный слой собирают в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре 40 °С и подвергают очистке на колонке по п. 9.3.

Экстракт, полученный по п. 9.1.1 и помещенный в круглодонную колбу, упаривают на ротационном вакуумном испарителе до водного остатка (8 - 10 куб. см) при температуре не выше 40 °С. К водному остатку прибавляют 15 куб. см насыщенного раствора хлорида натрия, перемешивают и переносят в делительную воронку вместимостью 100 куб. см. В воронку вносят 30 куб. см хлористого метилена, интенсивно встряхивают в течение 2-х мин. После разделения фаз нижний органический слой фильтруют через слой безводного сульфата натрия в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. Операцию экстракции водной фазы повторяют еще дважды, используя 30 и 20 куб. см хлористого метилена. Объединенную органическую фазу, пропущенную через слой сульфата натрия, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °С и подвергают дополнительной очистке на колонке по п. 9.3.

Сухой остаток в круглодонной колбе, полученный по пп. 9.1.2, 9.1.3 и 9.2., растворяют в 0,6 куб. см этилацетата, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., добавляют 2,4 куб. см гексана, перемешивают, вновь помещают в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на колонку, подготовленную по п. 7.2. Колбу обмывают 3 куб. см смеси гексан:этилацетат (8:2, по объему), которые также наносят на колонку. Промывают колонку 40 куб. см смеси гексан:этилацетат (1:1, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в сек., элюат отбрасывают. Тебуконазол элюируют с колонки 50 куб. см смеси гексан:этилацетат (2:8, по объему), собирая элюат непосредственно в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. Раствор упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре 40 °С. Остаток в колбе растворяют в 2,5 куб. см этилацетата, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., и анализируют на содержание тебуконазола по п. 9.4.

Колонка капиллярная кварцевая ZB-1, длина 30 м, внутренний диаметр 0,32 мм, толщина пленки 0,5 мкм, неподвижная фаза SE-30, фирма Phenomenex (США).

Температура термостата испарителя - 270 °С, детектора - 330 °С, термостата колонки (программа: от 180 °С (1 мин.) со скоростью 25°/мин. до 240 °С (0 мин.); со скоростью 5°/мин. до 255 °С (4 мин.); со скоростью 25°/мин. до 270 °С (2 мин.)

Расход газов: газа-носителя (азот) - 3,5 куб. см/мин.; водорода и воздуха к ТИД - 12,2 и 200 куб. см /мин. соответственно.

Деление потока: 1:2.

Время удерживания тебуконазола: около 8 мин.

Объем вводимой пробы: 1 куб. мм.

Линейный диапазон детектирования: 0,1 - 2,0 нг.

Каждую анализируемую пробу вводят 3 раза и вычисляют среднюю высоту хроматографического пика тебуконазола.

Образцы, дающие пики большие чем стандартный раствор с концентрацией 2,0 мкг/куб. см, разбавляют этилацетатом.

Содержание тубоконазола рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ ИСО 5725-1-6.2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

ГНУ ВНИИ фитопатологии.