"МУК 4.1.2064-06. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методические указания по определению остаточных количеств хизалофоп-П-этила в зерне гороха, семенах и масле подсолнечника по основному метаболиту хизалофоп-П кислоте методом капиллярной газожидкостной хроматографии"
(утв. Роспотребнадзором 05.05.2006)

1. Подготовлены Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана при участии специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Разработчики методов указаны в каждом из них.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко.

4. Введены впервые.

1.1. Краткая характеристика препарата.

Фирма производитель: ЗАО "Фирма Август".

Торговое название: Миура, КЭ.

Действующее вещество (д.в.): хизалофоп-П-этил.

Название д.в. по номенклатуре ИЮПАК: (R)-2-[4-[(6-хлорхиноксалин-2-илокси)-фенокси]пропионовой кислоты этиловый эфир.

Структурная формула д.в.: (не приводится).

Молекулярная масса д.в.: 372,8.

Химически чистое вещество: светло-коричневые кристаллы.

Температура плавления д.в.: 76 - 77 °C.

Давление пара д.в. при 20 °C: 0,011 мПа.

Растворимость д.в. (г/л) при 20 °C: в воде - 0,0004, в гексане - 5,0, этаноле - 22, ксилоле - 360, ацетоне - 650.

Стабильность д.в.: устойчив к действию света, разлагается до хизалофоп-П кислоты под действием разбавленных кислот и щелочей.

Гигиенические нормативы: ВМДУ в горохе и масле подсолнечника - 0,05 мг/кг, семенах подсолнечника - 0,02 мг/кг.

1.2. Краткая характеристика хизалофоп-П кислоты.

Название по номенклатуре ИЮПАК: (R)-2-[4-[(6-хлорхиноксалин-2-илокси)фенокси]пропионовая кислота.

Структурная формула: (не приводится).

Молекулярная масса д.в.: 344,8.

2.1.1. Принцип метода

Метод основан на количественном определении хизалофоп-П кислоты, основного метаболита хизалофоп-П-этила, и включает извлечение остаточных количеств хизалофоп-П кислоты из анализируемого объекта органическими растворителями, очистку экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей и метилирование хизалофоп-П кислоты диазометаном. Количественное определение проводят методом внешнего стандарта с применением капиллярной газожидкостной хроматографии и использованием термоионного детектора (ТИД).

2.1.2. Избирательность метода

Метод специфичен в присутствии других применяемых в сельском хозяйстве пестицидов. Способы очистки экстрактов, а также применение селективного детектора и капиллярной колонки позволяет устранять влияние коэкстрактивных веществ на результаты анализа.

2.1.3. Метрологическая характеристика метода

Диапазоны измеряемых концентраций, пределы обнаружения и другие метрологические параметры метода представлены в таблицах 1 и 2.

Аналитический стандарт хизалофоп-П кислоты.

Азот газообразный высокой чистоты, ТУ 301-07-25-89.

Ацетон, ос.ч. ТУ 2633-004-11291058-94.

Ацетонитрил для хроматографии, х.ч., ТУ 6-09-4326-76.

Вата медицинская, ТУ 9393-001-00302238-97.

н-Гексан, х.ч., ТУ 6-09-3375-78.

Дихлорметан, х.ч., ТУ 6-09-2662-77.

Изооктан эталонный, ГОСТ 12433-83.

Калия гидроокись, ч.д.а., ГОСТ 24363-80.

Натрий сернокислый б/в (сульфат), ч.д.а., ГОСТ 4166-76.

Натрий хлористый, ч.д.а., ГОСТ 4233-77.

N-Нитрозометилмочевина, х.ч., ТУ 6-09-11-1643-82.

Серная кислота, ос.ч., ГОСТ 14262-78.

Спирт этиловый ректификат (этанол), ГОСТ 17299-78.

Фильтры бумажные, красная лента, ТУ 2642-001-42624157-98.

Фильтры бумажные, белая лента, ТУ 2642-001-42624157-98.

Фильтры бумажные, синяя лента, ТУ 2642-001-42624157-98.

Эфир этиловый (серный), ОСТ 84-2006-88.

Газовый хроматограф с ТИД.

Колонка хроматографическая капиллярная кварцевая длиной 15 м, внутренним диаметром 0,32 мм с неподвижной фазой SE-52, толщина слоя - 0,45 мкм.

Аппарат для встряхивания, ТУ 64-1-1081-73 или аналогичный.

Весы аналитические типа ВЛА-200, ГОСТ 34104-80.

Весы лабораторные типа ВЛКТ-500, ГОСТ 24104-80.

Воронки делительные емкостью 250 и 500 мл, ГОСТ 25336-82.

Воронки химические конусные, ГОСТ 25336-82.

Индикаторная бумага универсальная, ТУ 6-09-1181-76.

Колбы-концентраторы емкостью 100 и 250 мл, ГОСТ 25336-82.

Колбы плоскодонные емкостью 100 и 300 мл, ГОСТ 25336-82.

Колбы мерные со шлифом емкостью 25, 50, 100 мл, ГОСТ 1770-74.

Колпачки алюминиевые для герметизации флаконов, ГОСТ Р 51314-99.

Мельница электрическая лабораторная, ТУ 46-22-236-79 или аналогичная.

Микрошприц МШ-10, ТУ 2-833-106.

Насос водоструйный, ГОСТ 10696-75.

Ротационный вакуумный испаритель типа ИР-1 или аналогичный.

Пипетки мерные емкостью 1, 2, 5 и 10 мл, ГОСТ 20292-74.

Приспособление для обжима колпачков на флаконах, ТУ 42-2-2442-73.

Пробирки мерные со шлифом емкостью 5,0 мл, ГОСТ 1770-74.

Стаканы химические на 100, 200 и 500 мл, ГОСТ 25336-82.

Установка для перегонки растворителей при атмосферном давлении.

Установка для упаривания растворителей в токе азота.

Установка ультразвуковая "Серьга" УЗМ002 или аналогичная.

Флаконы стеклянные (типа пенициллиновых) емкостью 5,0 мл, ТУ 64-2-10-87.

Электроплитка, ГОСТ 14919-83.

2.4.1. Подготовка и очистка растворителей

Перед началом работы рекомендуется проверить чистоту применяемых органических растворителей. Для этого 100 мл растворителя упаривают в ротационном вакуумном испарителе при температуре +40 °C до объема 1,0 мл и хроматографируют. При обнаружении мешающих определению примесей очистку растворителей производят в соответствии с общепринятыми методиками.

2.4.2. Приготовление стандартных растворов

Основной раствор хизалофоп-П кислоты с содержанием 100 мкг/мл готовят растворением в смеси ацетон:этанол (80:20) 0,01 г аналитического стандарта в мерной колбе емкостью 100 мл. Раствор хранят в холодильнике при температуре +4 - 6 °C не более трех месяцев.

Рабочие стандартные растворы с концентрациями 4,0, 2,0, 1,0 и 0,5 мкг/мл готовят из основного стандартного раствора хизалофоп-П кислоты соответствующим последовательным разбавлением ацетоном.

Для приготовления калибровочных растворов в мерные пробирки со шлифом емкостью 5,0 мл вносят по 1,0 мл рабочих растворов хизалофоп-П кислоты с концентрациями 0,5, 1,0, 2,0 и 4,0 мкг/мл. Растворители в пробирках упаривают в токе азота досуха и проводят метилирование хизалофоп-П кислоты.

В пробирки добавляют по 2,0 мл свежеприготовленного эфирного раствора диазометана (п. 2.4.4), закрывают притертыми пробками и ставят на 12 - 14 часов (на ночь) в холодильник с температурой +4 - 6 °C. После этого этиловый эфир в пробирках упаривают досуха в токе азота при комнатной температуре. Сухой остаток растворяют в 1,0 мл изооктана и хроматографируют по п. 2.6.3.

2.4.3. Построение калибровочного графика

Для построения калибровочного графика в инжектор хроматографа вводят по 2 мкл приготовленных по п. 2.4.2 растворов, содержащих хизалофоп-П кислоту (в виде хизалофоп-П-метила) в концентрациях 0,5, 1,0, 2,0 и 4,0 мкг/мл. Осуществляют не менее трех параллельных измерений и находят среднее значение высоты (площади) хроматографического пика для каждой концентрации. Строят калибровочный график зависимости высоты (площади) хроматографического пика в мм (кв. мм) от концентрации хизалофоп-П кислоты в рабочем растворе в мкг/мл.

2.4.4. Приготовление эфирного раствора диазометана (из расчета метилирования хизалофоп-П кислоты в экстрактах 2-х проб)

N-Нитрозометилмочевину массой 0,5 г помещают во флакон емкостью 2,0 - 3,0 мл и герметизируют резиновой пробкой и колпачком с помощью приспособления для обжима колпачков на флаконах. Этиловый эфир объемом 4,0 мл вносят в другой флакон емкостью 5,0 мл, герметизируют резиновой пробкой и колпачком и охлаждают в морозильной камере холодильника в течение 30 минут.

После этого флаконы через предварительно проколотые пробки соединяют гибкой тефлоновой трубкой (внутр. диам. ~ 1,5 - 2,0 мм), одним концом погружая ее в этиловый эфир на всю глубину (флакон с охлажденным этиловым эфиром обязательно должен еще иметь свободный выход в атмосферу). Во флакон с нитрозометилмочевиной, используя шприц с тонкой иглой и прокалывая пробку, добавляют по каплям по стенке 50% водный раствор гидроокиси калия (~ 0,3 мл) до прекращения реакции. Этиловый эфир при насыщении диазометаном окрашивается в ярко желтый цвет.

Внимание! Приготовление эфирного раствора диазометана и процедуру метилирования необходимо обязательно проводить в работающем вытяжном шкафу.

Отбор проб зерна гороха проводят в соответствии с ГОСТ 28674-90. "Горох. Требования по заготовке и поставке", семян и масла подсолнечника - ГОСТ 10852-86. "Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб".

Среднюю пробу зерна гороха измельчают, перемешивают и выделяют аналитические пробы. Для длительного хранения аналитические пробы зерна гороха помещают в морозильную камеру с температурой -18 °C и хранят в закрытой стеклянной или полиэтиленовой таре.

Пробы семян подсолнечника просушивают до стандартной влажности и хранят в закрытой стеклянной или полиэтиленовой таре. Перед анализом семена подсолнечника вылущивают, измельчают на лабораторной мельнице и после перемешивания измельченной массы отбирают усредненную аналитическую пробу.

Пробы масла подсолнечника хранят в холодильнике при 0 - 4 °C в закрытой стеклянной таре не более 2-х месяцев.

2.6.1. Зерно гороха и семена подсолнечника

2.6.1.1. Экстрагирование и очистка экстракта

Аналитическую пробу массой 25,0 +/- 0,1 г помещают в плоскодонную колбу емкостью 300 мл и добавляют к пробе зерна гороха 150 мл смеси ацетон:этанол (80:20), а к пробе семян подсолнечника 150 мл смеси ацетон:этанол:бидистиллированная вода (70:20:10). Содержимое колбы слегка встряхивают и подвергают обработке ультразвуком в УЗ-бане в течение 10 минут. После этого экстракт фильтруют через бумажный фильтр белая лента в колбу-концентратор емкостью 250 мл. Содержимое колбы с пробой промывают 50 мл ацетона, который также фильтруют в колбу-концентратор.

При использовании аппарата для встряхивания в колбу с аналитической пробой зерна гороха вносят 150 мл смеси ацетон:этанол (80:20), а к пробе семян подсолнечника добавляют 150 мл смеси ацетон:этанол:бидистиллированная вода (70:20:10). Содержимое колбы встряхивают в течение 60 минут. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр белая лента в колбу-концентратор емкостью 250 мл. Содержимое колбы с пробой промывают 50 мл ацетона, который также фильтруют в колбу-концентратор.

Колбу-концентратор с объединенным экстрактом подсоединяют к ротационному вакуумному испарителю и упаривают растворители до объема 10 - 20 мл при температуре +40 °C. В колбу-концентратор добавляют 200 мл бидистиллированной воды, 5,0 мл 10% водного раствора гидроокиси калия, перемешивают встряхиванием и помещают в холодильник с температурой +4 - 6 °C на 2 часа. После этого содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр красная лента в делительную воронку емкостью 500 мл. К содержимому воронки добавляют 10 мл насыщенного водного раствора хлористого натрия, 75 мл дихлорметана и воронку встряхивают в течение 2-х минут. После 5-минутного отстаивания нижний дихлорметановый слой сливают и отбрасывают. Эту процедуру очистки экстракта повторяют с использованием 50 мл дихлорметана. Далее в воронку добавляют 40 мл насыщенного водного раствора хлористого натрия, приливают 75 мл н-гексана и встряхивают содержимое воронки в течение 2-х минут. После 5-минутного отстаивания нижний водный слой собирают в химический стакан емкостью 300 мл, а верхний гексановый слой сливают и отбрасывают.

Водный раствор пробы, находящийся в химическом стакане, подкисляют концентрированной серной кислотой до pH 2,0 и переносят в чистую делительную воронку емкостью 500 мл. В воронку добавляют 75 мл смеси гексан:этиловый эфир (80:20) и встряхивают в течение 2-х минут. После полного разделения слоев нижний водный слой сливают в химический стакан, а верхний гексано-эфирный слой фильтруют через фильтр синяя лента со слоем безводного сульфата натрия (толщина слоя ~ 1,0 - 1,5 см) в колбу-концентратор емкостью 150 мл. Экстрагирование и фильтрование повторяют с использованием 50 мл смеси гексан:этиловый эфир (80:20). Нижний водный слой отбрасывают.

Колбу-концентратор с объединенным экстрактом подсоединяют к ротационному вакуумному испарителю и упаривают растворители до объема 3 - 5 мл при температуре +40 °C. Остаток экстракта количественно переносят из колбы-концентратора в мерную пробирку со шлифом емкостью 5,0 мл и упаривают растворители досуха в токе азота при температуре +50 °C.

2.6.1.2. Метилирование

После охлаждения до комнатной температуры в пробирку с сухим остатком добавляют 2,0 мл свежеприготовленного эфирного раствора диазометана (по п. 2.4.4). Пробирку закрывают притертой пробкой и ставят на 12 - 14 часов (на ночь) в холодильник с температурой +4 - 6 °C. После этого этиловый эфир в пробирке упаривают досуха в токе азота при комнатной температуре. Сухой остаток растворяют в 0,5 мл изооктана и проводят количественное определение хизалофоп-П кислоты по п. 2.6.3.

2.6.2. Масло подсолнечника

2.6.2.1. Экстрагирование и очистка экстракта

Аналитическую пробу масла массой 10,0 +/- 0,1 г растворяют в 50 мл гексана (насыщенного ацетонитрилом) в плоскодонной колбе емкостью 100 мл и после этого гексановый раствор масла переносят в делительную воронку емкостью 250 мл. Колбу промывают 50 мл ацетонитрила (насыщенного гексаном) и также переносят его в воронку. Содержимое воронки встряхивают в течение 2-х минут. После 5-минутного отстаивания нижний ацетонитрильный слой сливают в колбу-концентратор емкостью 250 мл. В делительную воронку добавляют еще 50 мл ацетонитрила (насыщенного гексаном). Содержимое воронки встряхивают в течение 2-х минут, отстаивают и нижний ацетонитрильный слой объединяют в колбе-концентраторе с предыдущим. Верхний гексановый слой отбрасывают.

Колбу-концентратор с объединенным ацетонитрильным экстрактом подсоединяют к ротационному вакуумному испарителю и упаривают растворитель до объема 10 - 20 мл при температуре +50 °C. В колбу-концентратор добавляют 200 мл дистиллированной воды, 5,0 мл 10% водного раствора гидроокиси калия, раствор перемешивают встряхиванием и выдерживают 2 часа в холодильнике с температурой +4 - 6 °C. После этого содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр белая лента в делительную воронку емкостью 500 мл. К содержимому воронки добавляют 10 мл насыщенного водного раствора хлористого натрия, 75 мл дихлорметана и воронку встряхивают в течение 2-х минут. После 5-минутного отстаивания нижний дихлорметановый слой сливают и отбрасывают. Эту процедуру очистки экстракта повторяют два раза с использованием каждый раз по 50 мл дихлорметана. Далее в воронку добавляют 40 мл насыщенного водного раствора хлористого натрия, приливают 75 мл н-гексана и встряхивают содержимое воронки в течение 2-х минут. После 5-минутного отстаивания нижний водный слой собирают в химический стакан емкостью 300 мл, а верхний гексановый слой сливают и отбрасывают.

Водный раствор пробы, находящийся в химическом стакане, подкисляют концентрированной серной кислотой до pH 2,0 и переносят в чистую делительную воронку емкостью 500 мл. В воронку добавляют 75 мл смеси гексан:этиловый эфир (80:20) и встряхивают в течение 2-х минут. После полного разделения слоев нижний водный слой сливают в химический стакан, а верхний гексано-эфирный слой фильтруют через фильтр синяя лента со слоем безводного сульфата натрия (толщина слоя ~ 1,0 - 1,5 см) в колбу-концентратор емкостью 150 мл. Экстрагирование и фильтрование повторяют с использованием 50 мл смеси гексан:этиловый эфир (80:20). Нижний водный слой отбрасывают.

Колбу-концентратор с объединенным экстрактом подсоединяют к ротационному вакуумному испарителю и упаривают растворители до объема 3 - 5 мл при температуре +40 °C. Остаток экстракта количественно переносят из колбы-концентратора в мерную пробирку со шлифом емкостью 5,0 мл и упаривают растворители досуха в токе азота при температуре +50 °C.

2.6.2.2. Метилирование

После охлаждения до комнатной температуры в пробирку с сухим остатком добавляют 2,0 мл свежеприготовленного эфирного раствора диазометана (по п. 2.4.4). Пробирку закрывают притертой пробкой и ставят на 12 - 14 часов (на ночь) в холодильник с температурой +4 - 6 °C. После этого этиловый эфир в пробирке упаривают досуха в токе азота при комнатной температуре. Сухой остаток растворяют в 0,5 мл изооктана и проводят количественное определение хизалофоп-П кислоты по п. 2.6.3.

2.6.3. Условия хроматографирования

Газовый хроматограф с ТИД.

Колонка хроматографическая капиллярная кварцевая длиной 15 м, внутренним диаметром 0,32 мм с неподвижной фазой SE-52, толщина слоя - 0,45 мкм.

Температура колонки: программирование от 180 °C (1 мин.) до 280 °C (15 мин.) со скоростью 10 °C/мин.

Температура испарителя: 250 °C.

Температура детектора: 290 °C.

Расход газов: газа-носителя (гелий марки "А") - 2,5 куб. см/мин., водорода и воздуха к ТИД - 30 и 250 куб. см/мин. соответственно, дополнительного газа (гелий марки "А") к ТИД - 30 куб. см/мин.

Объем вводимой пробы: 2 мкл.

Время удерживания хизалофоп-П кислоты (в виде производного): 13,2 +/- 0,1 мин.

Предел детектирования: 0,25 нг.

Линейный диапазон детектирования: 0,5 - 4,0 нг.

2.6.4. Обработка результатов анализа.

Содержание хизалофоп-П кислоты рассчитывают методом внешнего стандарта по формуле:

Необходимо соблюдать общепринятые правила техники безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, электронагревательными приборами и сжатыми газами, а также требования, изложенные в документации к приборам.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости результатов измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ ИСО 5725-1-6.2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

ВНИИ защиты растений.