"МУК 4.1.1424-03. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методические указания по определению остаточных количеств дитианона в воде, почве, яблоках, зерне и зеленой массе зерновых колосовых культур методом высокоэффективной жидкостной хроматографии"
(утв. Минздравом России 24.06.2003)

1. Методические указания подготовлены Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана (академик РАМН, проф. В.Н. Ракитский, проф. Т.В. Юдина) при участии Департамента госсанэпиднадзора Минздрава России (А.П. Веселов).

2. Методические указания рекомендованы к утверждению Комиссией по госсанэпиднормированию при Минздраве России.

3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко 24 июня 2003 г.

4. Введены с 30 июня 2003 г.

5. Введены впервые.

Настоящие методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения в воде, почве, яблоках, зерне и зеленой массе зерновых колосовых культур массовой концентрации дитианона в диапазонах 0,0025 - 0,025 мг/куб. дм; 0,02 - 0,2 мг/кг; 0,02 - 0,2 мг/кг; 0,02 - 0,2 мг/кг; 0,04 - 0,4 мг/кг.

Дитианон - действующее вещество препарата ДЕЛАН, СК (750 г/л), фирма-производитель БАСФ, Германия.

5,10-дигидро-5,10-диоксонафто[2,3-b]-1,4-дитиин-2,3-дикарбонитрил (IUPAC).

Структурная формула (не приводится).

Область применения препарата

Делан - фунгицид широкого спектра действия из класса хинонов, применяется на фруктовых, цитрусовых культурах, винограде, хмеле, кофе, пшенице и декоративных растениях в период после цветения.

Гигиенические нормативы:

ПДК в воде водоемов - 0,005 мг/куб. дм.;

ОДК в почве - 0,02 мг/кг.;

МДУ в яблоках, персиках - не допускается.

Метрологические характеристики метода представлены в таблицах 1 и 2.

--------------------------------

<*> Предел обнаружения в хроматографируемом объеме - 7,5 нг (хроматограф Милихром).

<**> Предел обнаружения в хроматографируемом объеме - 2 нг (хроматограф "Jasko", Япония).

Методика основана на определении вещества с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовым детектором после экстракции из анализируемой пробы воды хлороформом, почвы и растительного материала - ацетоном в кислой среде, очистки экстракта перераспределением между двумя несмешивающимися фазами и на колонке с силикагелем.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

В предлагаемых условиях определения метод специфичен в присутствии пестицидов, применяемых в технологии выращивания зерновых колосовых культур и яблок.

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичной или более высокой квалификацией.

Допускается применение хроматографических колонок и другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами по ГОСТу 12.1005.

4.2. При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТом 12.1.019 и инструкцией по эксплуатации прибора.

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, опыт работы на жидкостном хроматографе.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °С и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление растворов, подвижных фаз для ВЭЖХ, кондиционирование хроматографических колонок, установление градуировочных характеристик, подготовка колонки с силикагелем для очистки экстрактов, проверка хроматографического поведения вещества на колонке с силикагелем.

7.1.1. Очистка ацетонитрила

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора не менее 1 часа, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия.

7.1.2. Очистка ацетона

Растворитель сушат над молекулярными ситами 4А и подвергают фракционной перегонке на ректификационной колонне, целиком собранной из стекла с числом теоретических тарелок не менее 30. Сосуд для перегонки погружают в водяную баню и через приемник пропускают медленно струю сухого азота. Затем температуру водяной бани повышают до 70 - 75 °С и прибор промывают парами ацетона, после чего холодильник заполняют водой. До начала отбора главной фракции приемник несколько раз промывают дистиллятом. Перегонку продолжают до тех пор, пока в сосуде для перегонки не останется приблизительно 100 куб. см ацетона. Температуру водяной бани следует снижать по мере уменьшения объема ацетона, во всех случаях она не должна превышать температуру кипения ацетона более чем на 20°.

7.1.3. Очистка хлороформа

Хлороформ промывают последовательно 5%-ным водным раствором карбоната натрия, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над безводным карбонатом калия и перегоняют или подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретических тарелок не менее 50.

7.1.4. Очистка н-гексана

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до тех пор, пока она не перестанет окрашиваться в желтый цвет, водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над поташом.

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 500 - 600 куб. см хлороформа, вносят 1 куб. см ледяной уксусной кислоты, доводят до метки хлороформом, тщательно перемешивают.

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 575 куб. см ацетонитрила, 2 куб. см уксусной кислоты, добавляют 423 куб. см бидистиллированной воды, перемешивают, фильтруют и дегазируют.

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 550 куб. см ацетонитрила, 100 куб. см метанола, 2 куб. см уксусной кислоты, добавляют 348 куб. см бидистиллированной воды, перемешивают, фильтруют и дегазируют.

Промывают колонку подвижной фазой N 1 или N 2 (приготовленной по п. 7.3 или п. 7.4) в течение 30 минут при скорости подачи растворителя 0,1 куб. см/мин. или 1 куб. см/мин. до установления стабильной базовой линии.

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 990 куб. см метанола, добавляют 10 куб. см уксусной кислоты, перемешивают, фильтруют и дегазируют.

7.7.1. Исходный раствор дитианона в ацетонитриле для градуировки (концентрация 100 мкг/куб. см).

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 0,01 г дитианона, растворяют в 50 - 70 куб. см ацетонитрила, доводят до метки этим же растворителем, тщательно перемешивают. Раствор хранится в холодильнике в течение месяца.

Рабочие градуировочные растворы дитианона готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходного стандартного раствора.

7.7.2. Серия А (измерение по п. 9.5.1)

Рабочие градуировочные растворы N 1 - 4 (концентрация 2,5 - 25,0 мкг/куб. см).

В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают по 2,5, 5,0, 10,0 и 25,0 куб. см исходного стандартного раствора дитианона в ацетонитриле с концентрацией 100 мкг/куб. см, доводят до метки подвижной фазой N 1 (приготовленной по п. 7.3), тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 1 - 4 с концентрацией дитианона 2,5, 5,0, 10,0 и 25,0 мкг/куб. см.

Рабочие стандартные растворы хранятся в холодильнике в течение 5-ти дней.

7.7.3. Серия Б (измерение по п. 9.5.2)

7.7.3.1. Раствор N 5 дитианона для градуировки (концентрация 10 мкг/куб. см).

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 10 куб. см исходного стандартного раствора дитианона с концентрацией 100 мкг/куб. см (п. 7.7.1), разбавляют ацетонитрилом до метки. Раствор хранится в холодильнике в течение 5-ти дней.

7.7.3.2. Рабочие градуировочные растворы N 6 - 9 (концентрация 0,1 - 1,0 мкг/куб. см).

В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают по 1,0, 2,0, 5,0 и 10,0 куб. см стандартного раствора N 1 с концентрацией 10 мкг/куб. см (п. 7.7.1), доводят до метки смесью метанол - уксусная кислота (приготовленной по п. 7.6), тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 6 - 9 с концентрацией дитианона 0,1, 0,2, 0,5 и 1,0 мкг/куб. см соответственно. Растворы хранятся в холодильнике в течение 3-х дней.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади или высоты пика (отн. единицы, мм) от концентрации дитианона в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4-м растворам для градуировки N 1 - 4 или 6 - 9.

В инжектор хроматографа вводят по 3 или 20 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.5.1 или 9.5.2. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений.

Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см, внутренним диаметром 15 - 18 мм уплотняют тампоном из стекловаты, медленно выливают в колонку (при открытом кране) суспензию 15 г силикагеля в 50 куб. см хлороформа (колонка А) или 10 г силикагеля в 20 куб. см хлороформа (колонка Б). Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента. Колонку (А или Б) промывают 50 куб. см элюента для колоночной хроматографии (приготовленного по п. 7.2) со скоростью 1 - 2 капли в сек. После этого колонка готова к работе.

В круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 5 куб. см стандартного раствора N 5 с концентрацией дитианона 10 мкг/куб. см (для проверки поведения дитианона на колонке А) или 1 куб. см стандартного раствора N 9 с концентрацией дитианона 1 мкг/куб. см (для проверки поведения дитианона на колонке Б). Упаривают растворитель досуха, остаток растворяют в 1 куб. см элюента для колоночной хроматографии (приготовленного по п. 7.2) и вносят в подготовленную колонку А или Б соответственно.

Промывают колонку 50 куб. см элюента (приготовленного по п. 7.2) со скоростью 1 - 2 капли в сек. Фракционно (по 5 куб. см) отбирают элюат, упаривают, остатки растворяют в 1 куб. см подвижной фазы для ВЭЖХ N 1 (приготовленной по п. 7.3) или смеси растворителей (приготовленной по п. 7.6) и анализируют на содержание дитианона соответственно по п. 9.5.1 или 9.5.2.

Фракции, содержащие дитианон, объединяют вместе, упаривают досуха, остатки растворяют в 1 куб. см подвижной фазы для ВЭЖХ N 1 (приготовленной по п. 7.3) или смеси растворителей (приготовленной по п. 7.6) и вновь анализируют на содержание дитианона соответственно по п. 9.5.1 или 9.5.2.

Рассчитывают содержание вещества в элюатах, определяют полноту смывания с колонки и необходимый для очистки объем элюента.

Примечание: проверку хроматографического поведения дитианона следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии сорбентов и растворителей.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79).

Пробы воды необходимо анализировать в день отбора.

Образцы почвы и растительной продукции можно хранить в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике при температуре не выше 4 °С не более суток вне зависимости от сроков хранения продукции.

Для длительного хранения образцы замораживают (лучше жидким азотом) и хранят в морозильной камере при -10 °С в течение месяца, предварительно определяется содержание влаги.

Непосредственно перед анализом образцы зерна, яблок, зеленой массы измельчают, воду (при наличии взвеси) фильтруют через неплотный бумажный фильтр, сухую почву просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм.

9.1. Вода

500 куб. см (G) анализируемого образца воды помещают в делительную воронку вместимостью 1000 куб. см, добавляют 50 куб. см концентрированной соляной кислоты и 100 куб. см хлороформа, интенсивно встряхивают делительную воронку в течение 2-х мин. После полного разделения фаз нижний органический слой собирают в коническую колбу вместимостью 250 куб. см. Оставшуюся в делительной воронке водную фазу подвергают экстракции новыми порциями хлороформа объемом 50 куб. см еще дважды.

Объединенный экстракт сушат над безводным сульфатом натрия, переносят в круглодонную колбу, содержащую 0,1 куб. см уксусной кислоты, и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 45 °С. Далее проводят очистку согласно п. 9.4.2.

9.2. Почва, яблоки, зеленая масса

Навеску почвы, гомогенизированной пробы яблок массой 50 г (G), зеленой массы массой 25 г (G) смешивают в стакане со 100 куб. см ацетона и 5 куб. см соляной кислоты. Смесь тщательно перемешивают и помещают на аппарат для встряхивания на 30 мин. Смесь фильтруют, остаток на фильтре промывают 10 куб. см ацетона. Процедуру экстракции и промывки повторяют еще раз со 110 куб. см ацетона. Экстракты и промывки переносят в мерную колбу вместимостью 250 куб. см (Vex1) и доводят ацетоном до метки. Далее проводят очистку согласно п. 9.4.1.

Примечание: в отдельных случаях (например, яблоки) процесс экстракции может быть улучшен при добавлении 50 куб. см соляной кислоты вместо 5 куб. см. В этом случае проводят повторную экстракцию с использованием 80 куб. см ацетона.

В зависимости от типа и состава растительного материала может быть сделано следующее упрощение: 100 куб. см ацетонового раствора экстрагируют 1 раз 150 куб. см хлороформа. Хлороформную фазу осушают и упаривают на ротационном вакуумном испарителе почти досуха. В этом случае далее очистку проводят согласно п. 9.4.2.

9.3. Семена зерновых культур

Навеску 50 г (G) измельченного зерна смешивают в стакане со 110 куб. см хлороформа и 5 куб. см соляной кислоты. Смесь перемешивают в течение 10 мин., охлаждают до 0 °С и затем фильтруют через бумажный фильтр. Остаток на фильтре промывают 20 куб. см хлороформа. Процедуру экстракции и промывки повторяют со 130 куб. см хлороформа. Объединенные экстракты и промывки встряхивают в делительной воронке вместимостью 500 куб. см со 100 куб. см воды, содержащей 5 куб. см соляной кислоты. Нижнюю органическую фазу фильтруют через сульфат натрия, осушитель промывают 20 куб. см хлороформа. Объединив экстракт и промывку, упаривают их на ротационном вакуумном испарителе почти досуха. Очистку проводят согласно п. 9.4.2.

9.4. Очистка экстракта

9.4.1. Перераспределение в н-гексане и хлороформе

100 куб. см раствора ацетона (Vr1), полученного по п. 9.2, переносят в делительную воронку на 500 куб. см, добавляют 200 куб. см воды, 100 куб. см насыщенного раствора хлористого натрия и 100 куб. см гексана, смесь встряхивают и отделяют верхнюю гексановую фазу. Затем водную фазу встряхивают со 100 куб. см хлороформа и нижнюю (органическую) фазу объединяют с гексановым экстрактом.

Объединенный экстракт, осушенный безводным сульфатом натрия, упаривают на ротационном вакуумном испарителе почти досуха. Далее продолжают очистку согласно п. 9.4.2.

9.4.2. Очистка на колонке с силикагелем

Остатки в колбах, полученные по п. 9.1, 9.3 и 9.4.1, с помощью 5 куб. см смеси хлороформ - уксусная кислота, 999:1 (элюента для колоночной хроматографии, приготовленного по п. 7.2), количественно переносят на колонку А с силикагелем (остаток по п. 9.1) или колонку Б (остатки по п. 9.3 и 9.4.1). Колонку А промывают 40 куб. см, колонку Б - 70 куб. см элюента (приготовленного по п. 7.2). Первые 20 куб. см основного элюата отбрасывают, оставшееся количество (колонка А - 20 куб. см, колонка Б - 50 куб. см) собирают в грушевидную колбу вместимостью 100 куб. см, предварительно добавив в нее 0,1 куб. см уксусной кислоты. Элюат упаривают почти досуха, остаток растворителя отдувают в слабом токе азота (или воздуха). Сухой остаток экстракта воды растворяют в 0,5 куб. см ацетонитрила; почвы, яблок, зерна и зеленой массы - в 4 куб. см (Vend) смеси метанол - уксусная кислота, 99:1 (по объему), и анализируют на содержание дитианона соответственно по п. 9.5.1 или 9.5.2.

9.5. Условия хроматографирования

9.5.1. Жидкостной хроматограф с ультрафиолетовым детектором Милихром (Россия)

Колонка стальная длиной 64 мм, внутренним диаметром 2 мм, содержащая Сепарон С18 зернением 5 мкм

Температура колонки: комнатная

Подвижная фаза: ацетонитрил - вода - уксусная кислота (575:423:2 по объему)

Скорость потока элюента: 0,1 куб. см/мин.

Рабочая длина волны: 254 нм

Чувствительность: 0,2 ед. абсорбции на шкалу

Объем вводимой пробы: 3 куб. мм

Ориентировочный удерживаемый объем дитианона: 630 куб. мм

Линейный диапазон детектирования: 7,5 - 75 нг

Образцы, дающие пики, большие чем стандартный раствор с концентрацией 25 мкг/куб. см, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ N 1.

9.5.2. Жидкостной хроматограф с ультрафиолетовым детектором фирмы Jasko (Япония)

Предколонка стальная длиной 4,5 см, внутренним диаметром 4,6 мм, содержащая Altex Ultrasphere ODS зернением 5 мкм

Колонка стальная длиной 25 см, внутренним диаметром 4,6 мм, содержащая Altex Ultrasphere ODS зернением 5 мкм

Температура колонки: комнатная

Подвижная фаза: ацетонитрил - метанол - вода - уксусная кислота (560:100:348:2 по объему)

Скорость потока элюента: 1,0 куб. см/мин.

Рабочая длина волны: 254 нм

Чувствительность: 0,001 ед. абсорбции на шкалу

Объем вводимой пробы: 20 куб. мм

Ориентировочное время выхода дитианона: 10 мин.

Линейный диапазон детектирования: 2 - 20 нг

Образцы, дающие пики, большие чем стандартный раствор дитианона с концентрацией 1,0 мкг/куб. см, разбавляют смесью растворителей (приготовленной по п. 7.6).

Содержание дитианона рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:

а) почва, яблоки, зеленая масса растений:

б) вода, зерно:

где:

Х - содержание дитианона в пробе, мг/кг; мг/куб. дм;

С - концентрация дитианона в хроматографируемом растворе, найденная по градуировочному графику, мкг/куб. см;

Vex1 - общий объем экстракта по п. 9.2, куб. см;

Vr1 - аликвотная часть экстракта, взятая на анализ по п. 9.4.1, куб. см;

Vend - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;

G - масса (или объем) анализируемого образца, г (куб. см).

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с рекомендациями МИ 2335-95. ГСИ. Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа.

Юдина Т.В., Федорова Н.Е., Ларькина М.В. (Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана Минздрава РФ) - вода;

Тутельян В.А., Хотимченко С.А., Бессонов В.В. Институт питания РАМН, г. Москва - почва, яблоки, зерно, зеленая масса.