"МУК 4.2.1122-02. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Организация контроля и методы выявления бактерий Listeria monocytogenes в пищевых продуктах. Методические указания"
(утв. Минздравом России 22.04.2002)

1. Разработаны Федеральным центром госсанэпиднадзора Минздрава России (Л.Г. Подунова, Э.Ф. Опочинский, Н.С. Кривопалова), ГУ Научно - исследовательским институтом питания Российской Академии медицинских наук (В.А. Тутельян, С.А. Шевелева, И.Б. Куваева, Н.Р. Ефимочкина), Департаментом госсанэпиднадзора Минздрава России (Н.Н. Иванова), Научно - исследовательским институтом эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН (И.С. Тартаковский, С.А. Ермолаева, Т.С. Карпова), Центральным научно - исследовательским институтом эпидемиологии МЗ РФ (Б.Л. Черкасский), Центром госсанэпиднадзора в г. Москве (Н.Я. Салова, В.П. Голованова), Центром госсанэпиднадзора в Тульской области (Т.А. Попова), Всероссийским научно - исследовательским институтом мясной промышленности (Ю.Г. Костенко), Координационным микробиологическим центром рыбной промышленности ГИПРОРЫБФЛОТа (Л.Б. Мухина, Е.Ю. Дмитриева), Всероссийским научно - исследовательским институтом ветеринарной вирусологии и микробиологии (В.М. Котляров).

2. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации - Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации Г.Г. Онищенко 22.04.02.

3. Введены впервые.

1.1. Настоящие Методические указания устанавливают основные принципы организации контроля и методику проведения лабораторных исследований пищевых продуктов по выявлению в них бактерий Listeria monocytogenes.

При контроле пищевых продуктов на загрязненность патогенными микроорганизмами в СанПиН 2.3.2.1078-01 "Гигиенические требования к безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов" предусматривается новый микробиологический показатель "Listeria monocytogenes - не допускаются" в 25 г продуктов массового назначения и в 50 - 100 г для продуктов детского и специализированного питания.

Проведение контроля на Listeria monocytogenes позволит получить реальную картину ситуации в Российской Федерации, оценить степень загрязненности пищевой продукции и дать оценку эффективности принимаемых мер в целях обеспечения ее безопасности в плане новых и вновь возникающих возбудителей инфекций с пищевым путем передачи для здоровья и жизни человека.

1.2. Методические указания предназначены для применения в лабораториях учреждений государственной санитарно - эпидемиологической службы Российской Федерации, осуществляющих контроль за качеством продовольственного сырья и пищевых продуктов, в т.ч. импортируемых в Российскую Федерацию, гигиеническую оценку и выдачу санитарно - эпидемиологических заключений, а также бактериологическую диагностику заболеваний с пищевым путем передачи; в лабораториях других организаций, аккредитованных в установленном порядке на право проведения контроля безопасности пищевой продукции и продовольственного сырья; в организациях, независимо от форм собственности, осуществляющих производственный контроль продовольственного сырья и пищевых продуктов в процессе промышленного производства и выпуска продукции.

1.3. Методические указания являются обязательными при контроле пищевых продуктов в ходе проведения противоэпидемических мероприятий при возникновении вспышек, а также в порядке осуществления санитарно - эпидемиологического надзора.

1.4. Организация проведения контроля пищевых продуктов на Listeria monocytogenes.

Лабораторный контроль за отсутствием Listeria monocytogenes в пищевых продуктах, где нормируется этот показатель, проводится:

в порядке надзора за соблюдением установленных требований в области обеспечения качества и безопасности пищевых продуктов в ходе проверок изготовления и оборота пищевой продукции, оказания услуг в сфере торговли и общественного питания;

при экспертизе продукции и подтверждении соответствия требованиям нормативных документов для целей гигиенической оценки и выдачи санитарно - эпидемиологических заключений;

при контроле за безопасностью продукции изготовителем (производственный контроль);

в ходе проведения противоэпидемических мероприятий и при эпидрасследовании заболеваний.

1.5. При проведении контроля безопасности по показателю Listeria monocytogenes согласно Положению о государственной санитарно - эпидемиологической службе, утвержденному Постановлением Правительства Российской Федерации от 24 июля 2000 г. N 554, должен осуществляться периодический отбор образцов пищевой продукции.

1.5.1. Порядок контроля и кратность исследований должны устанавливаться в соответствии с методическими и инструктивными документами, утвержденными или согласованными в установленном порядке органами государственной санитарно - эпидемиологической службы Российской Федерации, при этом необходимо учитывать специфику производства, степень его эпидзначимости, материально - техническое оснащение и т.п.

Особого внимания должны заслуживать предприятия, вырабатывающие продукты детского питания, детские молочные кухни, пищеблоки детских лечебно - профилактических учреждений, стационаров для онкологических, гематологических больных, домов ребенка, родильных домов, домов престарелых и инвалидов и т.п.

При проведении текущего надзора рекомендуемая минимальная периодичность выборочного лабораторного контроля пищевой продукции массового потребления - 1 раз в квартал; для детского и диетического питания - 2 раза.

1.5.2. При производственном контроле организация и периодичность лабораторных исследований продукции по показателю Listeria monocytogenes должна устанавливаться изготовителем продукции в соответствии с действующими санитарными правилами и согласовываться с учреждениями государственной санитарно - эпидемиологической службы по месту расположения предприятия - изготовителя.

1.5.3. Контроль пищевых продуктов по показателю Listeria monocytogenes с целью гигиенической оценки для выдачи санитарно - эпидемиологических заключений и подтверждения соответствия установленным требованиям при проведении экспертизы осуществляется в уполномоченных лабораториях центров госсанэпиднадзора или других организаций, аккредитованных в установленном порядке.

1.6. В пищевых продуктах, предназначенных для непосредственного употребления в пищу, в отношении которых отсутствуют микробиологические нормативы или данные о возможности выделения Listeria monocytogenes, контроль Listeria monocytogenes не проводится, однако в случае заболеваний людей и/или нарушений в области обеспечения качества и безопасности пищевых продуктов образцы таких продуктов должны быть направлены на лабораторное исследование.

1.7. Организация лабораторных исследований на Listeria monocytogenes.

Допускается организация лабораторных исследований путем их поэтапного выполнения в лабораториях учреждений госсанэпидслужбы различных уровней. При отсутствии возможности идентификации выделенных культур последние могут быть переданы в лаборатории, располагающие соответствующей материально - технической базой и квалифицированным персоналом, для выдачи окончательного результата.

Методические указания содержат описание метода выявления бактерий Listeria monocytogenes, основанного на высеве определенного количества продукта в жидкие селективные среды, инкубировании посевов, выявлении в этих посевах бактерий, способных расти и образовывать типичные колонии на агаризованных дифференциально - диагностических средах. Принадлежность выделенных культур к Listeria monocytogenes определяется по биохимическим, морфологическим и другим свойствам.

Метод выявления L. monocytogenes в пищевых продуктах основан на применении специальных селективных и дифференциально - диагностических сред. Селективность сред по отношению к сопутствующей микрофлоре обеспечивается включением в их состав хлорида лития, акрифлавина, циклогексимида, налидиксовой кислоты, полимиксина или других антибиотиков. Внесение эскулина и цитрата аммония железа позволяет подтверждать наличие листерий по почернению среды за счет гидролиза эскулина в присутствии ионов Fe+. Подтверждающие тесты родовой и видовой идентификации включают окраску по Граму, определение подвижности выделенных на агаризованных средах типичных по физиологическим и морфологическим признакам культур, их способности восстанавливать нитраты до нитритов, сбраживать рамнозу, ксилозу и маннит, способности к гидролизу лецитина на ГРМ-среде с активированным углем, а также определение наличия В-гемолиза на кровяном агаре и дифференциацию L. monocytogenes от других гемолизирующих листерий в САМР-тесте с контрольными штаммами Staphylococcus aureus и Rhodococcus equi.

При необходимости для выявления L. monocytogenes в пищевых продуктах проводится постановка реакции нарастания титра фага (РНФ).

Предлагаемый метод обнаружения L. monocytogenes, гармонизированный с Международным стандартом ISO 11290-111996, предусматривает определение наличия или отсутствия L. monocytogenes в нормируемой массе продукта в соответствии с нормативами СанПиН 2.3.2.1078-01 "Гигиенические требования к безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов", выраженными в альтернативной форме и основанными на существующей системе отбора образцов и оценки результатов анализа по двухклассной системе.

Методические указания также содержат описание методики кондуктометрического определения L. monocytogenes в пищевых продуктах с использованием микробиологического анализатора "Бак Трак". Метод кондуктометрического анализа основан на регистрации изменений импеданса - сопротивления питательной среды, которые происходят в процессе роста и метаболической активности микроорганизмов.

Допускается использование других коммерческих питательных сред и диагностических препаратов аналогичного назначения для проведения исследований в соответствии с данным документом. При их применении следует руководствоваться рекомендациями изготовителя.

Питательные среды и биологические препараты импортного производства должны иметь международный сертификат качества ИСО 9000 или EN 29 000. Питательные среды и препараты отечественного производства должны вырабатываться по нормативной документации, утвержденной в установленном порядке.

4.1.1. Пептонно - солевой раствор - по ГОСТ 26669.

4.1.2. Изотонический (0,85%-ный водный) раствор хлорида натрия - по ГОСТ 26669.

4.1.3. Растворы и реактивы для постановки реакции нитратредукции - по ГОСТ 10444.8-99.

4.1.4. Приготовление растворов и реактивов для окраски препаратов по Граму - по ГОСТ 10444.1 или в соответствии с инструкцией по применению.

4.1.5. Раствор перекиси водорода для определения каталазы 3%-ный - по ГОСТ 30425.

Среды промышленного изготовления, поименованные в п. 3.3.2, готовятся согласно прописям на этикетке или в соответствии с рекомендациями фирмы.

Допускается применение сред лабораторного приготовления по п. п. 4.2.1- 4.2.10.

Приготовление питательных сред Pre-Media 403A и BiMedia 401A, 402A, 403A для определения листерий проводят в соответствии с МУК 4.2.590-96 "Бактериологические исследования с использованием микробиологического экспресс - анализатора "Бак Трак 4100".

4.2.1. Питательный агар с 1% глюкозы и питательный бульон с 1% глюкозы (МПА с 1% глюкозы, МПБ с 1% глюкозы) готовят в соответствии с ГОСТ 10444.1.

4.2.2. Триптон - соевый бульон с дрожжевым экстрактом (TSYEB) / триптон - соевый агар с дрожжевым экстрактом (TSYEA)

Состав среды (г/л): ферментативный гидролизат казеина - 17,0; пептон соевый - 3,0; натрий хлористый - 5,0; фосфат калия однозамещенный - 2,5; глюкоза - 2,5; дрожжевой экстракт - 6,0; агар микробиологический (для TSYEA) - 15,0.

Компоненты растворяют в 1000 куб. см дистиллированной воды, тщательно перемешивают, устанавливают pH 7,3 +/- 0,2 и автоклавируют при 121 °C в течение 15 мин.

4.2.3. Среды селективного обогащения типа бульона Фрейзера

Приготовление основы среды (г/л): ферментативный гидролизат казеина - 5,0; пептон - 5,0; мясной экстракт - 5,0; дрожжевой экстракт - 5,0; натрий хлористый - 20,0; калия дигидрофосфат - 1,35; натрия гидрофосфат - 12,0; эскулин - 1,0; литий хлористый - 3,0; железа аммонийного цитрат - 0,25 растворяют в 1000 куб. см дистиллированной воды, тщательно перемешивают, устанавливают pH 7,2 +/- 0,2 и автоклавируют при 121 °C 15 мин.

Перед употреблением в основу среды вносят асептический раствор селективных компонентов следующего состава:

4.2.3.1. Для приготовления среды типа бульона Фрейзера первичного обогащения <*>: налидиксовой кислоты - 10 мг, акрифлавина гидрохлорид - 12,5 мг растворить в 10 куб. см стерильного 0,2 N гидроксида натрия.

--------------------------------

<*> Допускается при приготовлении среды типа бульона Фрейзера первичного обогащения готовить основу среды без добавления эскулина и цитрата железа аммонийного.

4.2.3.2. Для приготовления среды типа бульона Фрейзера вторичного обогащения: налидиксовой кислоты - 20 мг, акрифлавина гидрохлорид - 25 мг растворить в 10 куб. см стерильного 0,2 N гидроксида натрия.

Готовые среды разливают в стерильные колбы или пробирки и хранят в защищенных от света условиях при температуре не выше 8 °C.

4.2.4. PALCAM-агар (полимиксин-акрифлавин-лития хлорид-цефтазидим-эскулин-маннитол-агар) - селективная дифференциально - диагностическая среда для выделения листерий

Приготовление основы среды (г/л): пептон мясной ферментативный - 23,0; дрожжевой экстракт - 3,0; крахмал - 1,0; натрия хлорид - 5,0; эскулин - 0,8; лития хлорид - 15,0; железа аммония цитрат - 0,5; глюкоза - 0,5; маннит - 10,0; феноловый красный - 0,08; агар - 15,0 растворяют в 1000 куб. см дистиллированной воды, тщательно перемешивают, устанавливают pH 7,0 +/- 0,2 и автоклавируют при 121 °C 15 мин.

К стерильной расплавленной основе среды добавляют асептически раствор селективных компонентов следующего состава: акрифлавин - 0,005; полимиксин "В" - 100000 ед.; цефтазидим - 0,02 в 10 куб. см стерильной дистиллированной воды.

Готовую среду разливают в стерильные чашки Петри и хранят в защищенных от света условиях при температуре не выше 8 °C.

4.2.5. Селективная дифференциально - диагностическая среда для выделения листерий типа Оксфорд - агара

Приготовление основы среды (г/л): пептон мясной ферментативный - 23,0; крахмал кукурузный - 1,0; натрия хлорид - 15,0; эскулин - 1,0; лития хлорид - 15,0; железа аммония цитрат - 0,5; глюкоза - 0,5; агар - 15,0 растворяют в 1000 куб. см дистиллированной воды, тщательно перемешивают, устанавливают pH 7,0 +/- 0,2 и автоклавируют при 121 °C 15 мин.

К стерильной расплавленной основе среды добавляют асептически раствор селективных компонентов следующего состава: акрифлавина гидрохлорид - 0,005; циклогексимид - 0,4, колистина сульфат <*> - 0,02, цефатетан <*> - 0,002, фосфомицин <*> - 0,01 мг в 10 куб. см 50%-ного этилового спирта.

--------------------------------

<*> Допускается замена комплекса перечисленных антибиотиков на полимиксин в количестве 500000 ед. на 1 л.

Готовую среду разливают в стерильные чашки Петри и хранят в защищенных от света условиях при температуре не выше 8 °C.

4.2.6. Кровяной агар

К растопленному и охлажденному до 45 - 50 °C питательному агару с 1% глюкозы (п. 4.2.1) добавляют 5% по объему дефибринированной крови животных. Разливают в чашки Петри диаметром 90 мм по 15 куб. см среды и подсушивают при 37 °C.

Засев производят в теплые чашки.

4.2.7. Питательный агар с эритроцитами барана

Дефибринированную или стабилизированную цитратом кровь барана центрифугируют в асептических условиях 30 мин. при 900 об./мин. Надосадочную жидкость сливают. Осадок суспендируют в стерильном физиологическом растворе до первоначального объема, добавляют в количестве 5% по объему к растопленному и охлажденному до 45 - 50 °C питательному агару (п. 4.2.1). Разливают в чашки Петри по 10 куб. см, подсушивают при 37 °C. Чашки используют для посева теплыми.

4.2.8. Среда для определения подвижности

20 г гидролизата казеина ферментативного, 6 г пептона мясного ферментативного и 5 г агара растворяют в 1000 куб. см дистиллированной воды, устанавливают pH 7,3 +/- 0,2, разливают в пробирки по 5 - 7 куб. см и автоклавируют при 121 °C 15 мин.

4.2.9. Среды Гисса по ГОСТ 10444.1 с маннитом, рамнозой, ксилозой

10 г пептона ферментативного и 5 г натрия хлористого растворяют в 1000 куб. см дистиллированной воды и добавляют 10 г соответствующего углевода. Устанавливают pH 7,1 +/- 0,1, вносят 10 мл индикатора Андреде (также возможно использование индикатора бромкрезолового пурпурного, "ВР" и др.), разливают в пробирки и стерилизуют при 112 °C в течение 20 мин.

4.2.10. Среда для определения лецитиназной активности листерий

К среде ГРМ N 1 перед стерилизацией добавляют активированный уголь, растертый до порошкообразного состояния, до концентрации 0,5% (вес / объем). Желток куриного яйца разводят в 150 мл физиологического раствора и добавляют 5% по объему к стерилизованному и охлажденному до 40 - 50 °C питательному агару. Разливают в чашки Петри по 20 куб. см и подсушивают при 37 °C. Аналогично готовят среду с добавлением желтка, но без добавления активированного угля.

Отбор и подготовку проб продукции производят в соответствии с ГОСТ 26668-85 "Методы отбора проб для микробиологических анализов", ГОСТ 26669-85 "Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов", МУК 4.2.577-96 "Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов", ГОСТ Р 51446 (ИСО 7218-96), а также в соответствии с действующими ГОСТ и НД на конкретные виды продуктов.

Масса или объем отбираемых проб должны быть достаточными для проведения исследования и минимально вдвое превышать аналитический образец. Из точечных проб составляют навеску массой 25 +/- 0,1 г (50 - 100 г - для продуктов детского, лечебного и специализированного питания).

От продукции в потребительской таре в мелкой фасовке пробы отбирают в количестве одной или нескольких единиц в зависимости от массы или объема потребительской тары, с тем чтобы количество было достаточным для проведения анализа.

От продукции в транспортной или потребительской таре больших размеров или неупакованной пробы отбирают из разных мест с различной глубины, включая поверхность.

Для микробиологических анализов пробы отбирают до взятия проб на физико - химические и органолептические анализы стерильным инструментом в стерильную посуду. При этом от образца отбирают несколько точечных проб из разных мест, которые измельчают и перемешивают, из них составляют навеску 25 г.

Замороженные продукты предварительно размораживают до температуры внутри продукта 0 - (-1) °C; продукты, содержащие жиры (сливочное масло, мороженое), нагревают до температуры 40 - 45 °C и перемешивают.

Отобранные образцы перемешивают и измельчают или доводят до однородной консистенции по ГОСТ 26669, из измельченной суспензии составляют навеску необходимой массы.

При посевах высококислотных или щелочных (с pH < 6 или > 7,5) жидких и твердых продуктов для предотвращения снижения pH питательных сред на 0,5 и более pH продукта перед посевом доводят до 7,0 +/- 0,2 по ГОСТ Р 50480.

Отбор и подготовку проб продуктов проводят согласно ГОСТ 3622-68 "Молоко и молочные продукты. Отбор и подготовка их к испытанию" и 9225-84 "Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического анализа".

Кисломолочные продукты, сыр, творог, творожные изделия и пастообразные продукты тщательно измельчают с помощью гомогенизаторов перистальтического типа или ножевых и подвергают нейтрализации, масло сливочное и мороженое растапливают до сметанообразной консистенции.

Отбор и подготовку проб мяса, субпродуктов, мясных полуфабрикатов, колбасных изделий и других мясных продуктов проводят по ГОСТ 21237 "Мясо. Методы бактериологического анализа", ГОСТ 4288 "Изделия кулинарные и полуфабрикаты из рубленого мяса", ГОСТ 9958, ГОСТ 9792 "Колбасные изделия и продукты из свинины, баранины, говядины и мяса других видов убойных животных и птиц".

Массу навески отбирают в соответствии с п. 6.1.

Отбор и подготовку проб мяса птицы, субпродуктов и птичьих полуфабрикатов проводят по ГОСТ Р 50396.0 "Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты птичьи. Методы отбора проб и подготовка к микробиологическим исследованиям".

Отбор и подготовку к анализу проб плодоовощной продукции проводят согласно ГОСТ 26668, ГОСТ 26669, ГОСТ 26313 "Продукты переработки плодов и овощей. Правила приемки, методы отбора проб", кроме подготовки к анализу проб поверхностно - контаминированных и пюреобразных продуктов. Для поверхностно - контаминированной и быстрозамороженной плодоовощной продукции подготовку проводят согласно "Инструкции по микробиологическому контролю быстрозамороженной плодоовощной продукции" (МЗ СССР, 29.09.89, прил. 1, п. 1.3). Для анализа поверхностно - контаминированной продукции готовят суспензию добавлением к навеске массой (100 +/- 30) г, отобранной из трех единиц тары или фасовки, 0,1%-ного пептонно - солевого раствора в количестве, равном массе навески. При этом 1 куб. см полученной суспензии оценивают как 1 г (куб. см) продукта.

Из измельченных плодов, овощей, полуфабрикатов и пюреобразных и жидких отбирают раздельно навески массой по (100 +/- 30) г из трех единиц тары или фасовки и готовят объединенную пробу массой в соответствии с п. 6.1.

Отбор и подготовку проб проводят согласно "Инструкции по санитарно - микробиологическому контролю производства пищевой продукции из рыбы и морских беспозвоночных" N 5319-91 от 22.02.91 и ГОСТ 7631-85 "Рыба, морские млекопитающие, морские беспозвоночные и продукты их переработки. Правила приемки, органолептические методы оценки качества, методы отбора проб для лабораторных испытаний".

Отбор проб свежей, охлажденной и мороженой рыбы проводят от 2 точечных образцов, мышечная ткань в которых составляет не менее 25 г по ГОСТ 7631-85. Из каждой точечной пробы стерильным инструментом вырезают спинные мышцы с кожей, перемешивают и отвешивают 25 г, затем измельчают с помощью гомогенизаторов перистальтического типа или ножевых и гомогенизируют в 225 куб. см среды накопления.

Отбор и подготовку проб продуктов детского, лечебного питания и их компонентов проводят согласно МУК 4.2.577-96 "Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов".

Отобранные пробы продуктов перед исследованием тщательно перемешивают, кисломолочные продукты нейтрализуют (на 10 куб. см/г исследуемого продукта или его первого разведения для сухих кисломолочных продуктов, напитка или закваски добавляют 1,0 куб. см стерильного раствора двууглекислого натрия с массовой концентрацией 100 г/куб. см). Сыр, творог, творожные изделия и пастообразные продукты тщательно измельчают и нейтрализуют. Топленое масло или молочный жир расплавляют при температуре 40 - 45 °C и перемешивают до получения однородной эмульсии.

6.1. Подготовленную в соответствии с п. 5. навеску исследуемого продукта (гомогената, смыва с поверхности) в количестве 25 г (куб. см) вносят в одну из сред для первичного обогащения в количестве 225 куб. см (по п. п. 3.3.2.2, 4.2.3.1). При необходимости анализа других масс продукта их посев проводят в среду также в соотношении 1:9 по объему.

Посевы термостатируют при 37 °C в течение (24 +/- 2) ч. При росте листерий на средах предобогащения, содержащих эскулин и цитрат железа, аммонийного, наблюдается почернение среды за счет гидролиза гликозида эскулина до глюкозы и эскулетина. Эскулетин реагирует с ионами железа, образуя комплекс черного или оливкового цвета. На других средах почернения не отмечается.

6.2. После термостатирования продукта в среде для первичного обогащения 0,1 куб. см суспензии пересевают в 10 куб. см одной из жидких сред для вторичного обогащения по п. п. 3.3.2.2, 4.2.3.2. Посевы термостатируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение 48 ч. В средах с эскулином отмечают почернение как признак возможного присутствия бактерий рода Listeria.

6.3. Из пробирок после термостатирования, независимо от наличия или отсутствия признаков роста, и в т.ч. почернения, делают пересев по 0,1 куб. см на поверхность двух чашек Петри с одной из агаризованных дифференциально - диагностических сред по п. п. 3.3.2.3, 4.2.4, 4.2.5. Посевной материал растирают стерильным шпателем. Допускается проводить пересев петлей штрихом. Чашки со средами предварительно подсушивают.

Посевы термостатируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение 24 - 48 ч.

6.4. Проведение анализа без этапа вторичного обогащения

При посеве продуктов с низким исходным уровнем микробной контаминации и при отсутствии признаков роста в жидкой среде (помутнение, почернение и др.) допускается проводить пересев на чашки с агаризованными дифференциально - диагностическими средами сразу после этапа первичного обогащения по п. 6.2.

6.5. При отсутствии роста на чашках с дифференциально - диагностическими средами типа Оксфордского агара и PALCAM-агара анализ прекращают и дают заключение об отсутствии L. monocytogenes в исследованной пробе продукта.

6.6. При обнаружении характерного роста на чашках отбирают 3 - 5 колоний для их дальнейшего изучения.

На средах типа PALCAM-агара через 24 ч инкубирования листерии формируют мелкие, серовато - зеленые или оливково - зеленые колонии с черным ореолом, диаметром 0,5 - 1,0 мм, иногда с черным центром. Через 48 ч колонии диаметром 1,0 - 2,0 мм приобретают зеленую окраску с углубленными центрами, окруженными черным ореолом. Кокковая микрофлора (бактерии родов Staphylococcus, Enterococcus) образует желтые колонии за счет ферментации маннита.

На Оксфордском агаре (Oxford - agar) листерии, выращенные в течение 24 ч, - мелкие (1 мм), сероватые, окруженные черным ореолом. Через 48 ч - более темные, около 2 мм в диаметре, с черным ореолом и углубленным центром.

При появлении сплошного роста листерий производят пересев бактериологической петлей из зон наибольшего почернения среды штрихами на 2 - 3 чашки Петри с селективной дифференциально - диагностической питательной средой (Оксфордский или PALKAM-агар) для получения изолированных колоний. Посевы термостатируют аналогично п. 6.3.

6.7. Отобранные характерные колонии, подозрительные на принадлежность к Listeria monocytogenes, пересевают на среды: МПА с 1% глюкозы (п. 4.2.1), триптон - соевый агар с дрожжевым экстрактом (TSYEA) по п. 3.3.2.1 или 4.2.2 для получения изолированных колоний, которые подвергают дальнейшему изучению.

Посевы термостатируют при температуре 30 °C в течение 24 ч.

6.8. Идентификация выделенных культур

Для определения принадлежности выделенных микроорганизмов к роду Listeria полученные на средах культивирования чистые культуры микроскопируют по Граму, определяют наличие у них каталазы, подвижность при двух температурах инкубирования - 22 и 37 °C, способность к ферментации маннита и ставят реакцию нитрат - редукции.

6.8.1. Окраска по Граму

Бактерии рода Listeria являются грамположительными тонкими короткими палочками, спор не образуют.

6.8.2. Каталазную активность культур определяют в соответствии с ГОСТ 30425 по способности каталазы разлагать перекись водорода с выделением пузырьков газа. Реакцию ставят с охлажденной до комнатной температуры суточной культурой на стерильном предметном стекле. Изолированную колонию, взятую с поверхности питательной среды, растирают на стекле и пипеткой наносят каплю 3%-ного раствора перекиси водорода. Если через 30 - 60 с на стекле появляются пузырьки газа, то считают результаты реакции положительными. Параллельно ставят контрольную пробу.

Бактерии рода Listeria являются каталазоположительными.

6.8.3. Подвижность культур определяют посевом уколом в среды по п. п. 3.3.2.3 и 4.2.8 и инкубированием при двух температурах - 25 и 37 °C в течение 48 - 72 ч.

Бактерии рода Listeria подвижны при 20 - 25 °C (образуют характерный рост вокруг линии укола, похожий на зонтик) и неподвижны (или слабоподвижны) при 35 - 37 °C.

6.8.4. Для определения способности сбраживать углеводы культуры пересевают на пестрый ряд в среды Гисса по п. п. 3.3.2.3 или 4.2.9. Посевы термостатируют 7 дней при 37 °C, наличие ферментативной активности в отношении углеводов определяют по изменению окраски сред за счет образования кислоты.

Большинство бактерий рода Listeria не утилизируют маннит (за исключением L. grayi и L. grayi subsp. murrayi).

6.8.5. Постановку реакции нитрат - редукции проводят по ГОСТ 10444.8-88. Бактерии рода Listeria не восстанавливают нитраты до нитритов (за исключением L. grayi и L. grayi subsp. murrayi).

Обнаружение в посевах грамположительных коротких тонких палочек, каталазоположительных, не восстанавливающих нитраты до нитритов, не утилизирующих маннит, подвижных при 25 °C и неподвижных при 37 °C указывает на принадлежность выделенных на дифференциально - диагностических средах культур с характерной морфологией к роду Listeria.

Для подтверждения принадлежности выделенных листерий к виду L. monocytogenes определяют способность к ферментации рамнозы, ксилозы, наличие лецитиназной и бета - гемолитической активности и проводят постановку КАМП-теста (CAMP-test). Дифференцирующие признаки видов рода Listeria указаны в табл. 1.

Для видовой дифференциации выделенных культур листерий допускается использовать биохимические тест - системы API Listeria фирмы "BioMerieux". При их применении следует руководствоваться рекомендациями изготовителя.

6.8.6. Наличие способности ферментировать рамнозу и ксилозу - определяют аналогично п. 6.8.4. Бактерии L. monocytogenes утилизируют рамнозу с образованием кислоты и не утилизируют ксилозу.

6.8.7. Бета - гемолитическую активность исследуемых культур определяют по образованию зон просветления за счет растворения эритроцитов вокруг колоний при посеве на поверхность кровяного агара, приготовленного с добавлением стерильной дефибринированной крови барана или кролика. Посевы на кровяном агаре (п. п. 3.3.2.3, 4.2.6) термостатируют при 37 °C в течение 24 ч.

Listeria monocytogenes обладают бета - гемолитической активностью (образуют узкие четкие зоны просветления вокруг колоний).

6.8.8. Постановку КАМП-теста проводят для дифференциации L. monocytogenes от других видов листерий, обладающих гемолитической активностью.

Для проведения теста 2 - 3-суточные культуры геополитических штаммов Staphylococcus aureus и Rhodococcus equi засевают на кровяной агар с эритроцитами барана двумя параллельными штрихами на расстоянии 5,0 - 5,5 см, как показано на рис. 1 <*>.

--------------------------------

<*> Не приводится.

Между вертикальными штрихами St. aureus и Rh. equi засевают параллельными штрихами исследуемые культуры листерий на расстоянии друг от друга не менее 1 см и от вертикальных штрихов - 0,5 см. В качестве контрольных используют тест - штаммы L. monocytogenes и L. ivanovii. Инкубацию проводят 24 ч при 37 °C. Отмечают форму и размеры зон гемолиза около вертикальных штрихов роста стафилококка и родококка.

Listeria monocytogenes дает расширение зоны гемолиза около штриха St. aureus (положительный КАМП-тест) и имеет отсутствие изменений зоны гемолиза рядом со штрихом Rh. equi (отрицательный КАМП-тест).

6.8.9. Для определения лецитиназной активности дно двух чашек Петри со средой ГРМ N 1, содержащих: 1 чашка - желток куриного яйца и активированный уголь, 2 чашка - желток куриного яйца без активированного угля - делят на несколько секторов или квадратов, исследуемые культуры и контрольные штаммы листерий пересевают параллельно короткими штрихами на соответствующие секторы чашек, содержащих и не содержащих уголь. Инкубируют 48 ч при 37 °C. Чашки просматривают в проходящем свете и определяют наличие активности в присутствии и в отсутствие активированного угля, сравнивая с контрольными высевами музейных штаммов. Listeria ivanovii дает плотную зону помутнения шириной 3 - 6 мм независимо от присутствия активированного угля. Listeria monocytogenes дает аналогичную зону помутнения в присутствии активированного угля и не дает при отсутствии угля. Другие виды листерий не дают зоны помутнения.

6.9. Учет результатов

Результат оценивают по каждой исследованной пробе отдельно. В образце продукта констатируют присутствие Listeria monocytogenes, если при посеве на селективные среды выделены короткие неспорообразующие грамположительные палочки, каталазоположительные, подвижные при 25 °C и неподвижные при 37 °C, утилизирующие эскулин, сбраживающие с образованием кислоты рамнозу и не сбраживающие маннит и ксилозу, не восстанавливающие нитраты до нитритов, обладающие бета - гемолитической активностью, дающие положительную реакцию в КАМП-тесте со Staphylococcus aureus и отрицательную - с Rhodococcus equi, проявляющие лецитиназную активность на среде ГРМ N 1 с добавлением желтка куриного яйца и в присутствии активированного угля.

Результаты выявления Listeria monocytogenes в определенной навеске продукта записывают: "Listeria monocytogenes обнаружены в 25 г (куб. см) (в 50 - 100 г - для продуктов детского, лечебного и специализированного питания) продукта" или "Listeria monocytogenes не обнаружены в 25 г (куб. см) (в 50 - 100 г - для продуктов детского, лечебного и специального питания) продукта".

Результат оценивают по каждой пробе отдельно.

Для предварительного обогащения используется среда Pre-Media 403A.

Необходимое количество продукта, в котором регламентируется отсутствие L. monocytogenes, смешивают со средой Pre-Media 403A в соотношении 1/10, затем образец гомогенизируют и инкубируют в течение 24 ч.

Для обогащения используют одну из сред: BiMedia 401A, BiMedia 402A, BiMedia 403A.

Среду BiMedia 403A (401A, 402A) оставляют уравновеситься при комнатной температуре в течение 12 ч. Устанавливают температуру 37 °C на приборе "Бак Трак".

В основном меню программы "Бак Трак" устанавливают следующие параметры.

Добавляют в каждую измерительную ячейку по 10 куб. см среды BiMedia и вносят по 0,1 куб. см предобогащенного образца, тщательно перемешивают содержимое, вращая ячейку между ладонями (не переворачивая).

Для контроля среды используют одну измерительную ячейку с 10 куб. см среды BiMedia (без инокулята).

Выбирают в основном меню программы ЗАПУСК ИЗМЕРЕНИЙ (Start Measurement) и начинают измерения.

После того как каждая позиция в блоке будет отмаркирована как свободная на экране монитора, измерительные ячейки помещают в прибор "Бак Трак". Измерение начинается автоматически через 1 ч после загрузки ячеек в прибор. Рост микроорганизмов и время определения изменения импеданса (IDT) записываются автоматически.

Учет результатов

Образец загрязнен листериями, если изменение импеданса превышает 15%-ное пороговое значение по Е-параметру в течение 30 ч.

Подтверждение Listeria - позитивных образцов. В случае положительного ответа на листерии проводится подтверждение роста и идентификация до L. monocytogenes с высевом на селективные питательные среды в соответствии с п. п. 6.3 - 6.8. Высев производится непосредственно из измерительной ячейки.

Выросшие культуры подвергают идентификации по п. 6.8.

Учет результатов и выдача ответа - по п. 6.9.

РНФ может быть использована в качестве дополнительного метода для обнаружения L. monocytogenes в пищевых продуктах (при проведении противоэпидемических мероприятий и при эпидрасследовании).

Реакция нарастания титра фага - быстрый специфический метод обнаружения листерий, обеспечивающий выявление возбудителя в исследуемом материале без выделения культуры.

РНФ основана на свойстве индикаторного бактериофага строго специфично размножаться в клетках гомологичного микроба. Размножение бактериофага сопровождается увеличением количества его частиц и повышением титра.

8.1. В реакции применяют листериозные бактериофаги L2A и L4A. Штаммы L. monocytogenes - I (9 - 127) и II (9 - 72) серогрупп. Питательные среды, содержащие 0,5% глюкозы: мясопептонный бульон, 1,5%-ный и 0,7%-ный мясопептонный агар.

8.2. При постановке РНФ с пробами пищевых продуктов отвешивают 25 г исследуемого материала, измельчают, помещают в колбу емкостью 1000 куб. см и добавляют 250 куб. см МПБ. Смесь в течение 5 - 10 мин. встряхивают, затем 9 куб. см переносят в бактериологическую пробирку N 1 (опыт).

Смесь фагов готовят путем смешивания равных объемов фага L2A и L4A в рабочем разведении.

8.4. Для контроля титра бактериофага, который ставят один на группу анализов, проводимых одновременно, в пробирку N 2 (контроль) вносят 9 куб. см МПБ.

8.5. В пробирки N 1 и 2 вносят по 1 куб. см смеси фага в рабочем разведении (рис. 2) и выдерживают их в течение 16 - 24 ч при комнатной температуре, после чего в пробирки добавляют по 1 куб. см хлороформа. Содержимое тщательно встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 30 - 40 мин. Хлороформ оседает на дно, надосадочную жидкость подвергают дальнейшим исследованиям.

8.6. При использовании смеси фагов из опытной и контрольной пробирок (N 1 и 2) берут по 0,2 куб. см и переносят по 0,1 куб. см в две пробирки, содержащие по 0,9 куб. см МПБ (один ряд для обнаружения фага L2A, а другой - L4A), а затем из каждой пробирки готовят еще одно десятикратное разведение.

8.7. Готовят взвесь штаммов I и II серогруппы по стандарту мутности 10 ед. путем разведения суточной агаровой культуры в физиологическом растворе. Во все пробирки с разведенным материалом добавляют по 0,1 куб. см взвеси, штамма 1 серогруппы для выявления фага L2A или штамма II серогруппы для обнаружения фага L4A.

Содержимое пробирок засевают методом агаровых слоев по Грациа. Для этого накануне дня исследования в бактериологические чашки Петри разливают по 10 куб. см 1,5%-ного МПА; МПА можно разлить в чашки Петри и в день исследования, но в этом случае поверхность агара необходимо предварительно подсушить в течение 40 - 50 мин. при 37 °C или 2 ч при комнатной температуре. Для второго слоя используют расплавленный и охлажденный до 48 - 50 °C 0,7%-ный МПА, который следует использовать в течение часа, так как позже он приобретает гелеобразную консистенцию и непригоден для исследования.

Затем в пробирки пипеткой вносят по 2,5 - 3 куб. см расплавленного и охлажденного до 48 - 50 °C 0,7%-ного МПА. Содержимое быстро и тщательно перемешивают вращением пробирки между ладонями и выливают в чашку Петри. Смесь легким покачиванием чашки равномерно распределяют вторым слоем на поверхности 1,5%-ного МПА. Чашки оставляют на ровном месте на 20 - 30 мин. (до застывания 0,7%-ного МПА), затем переворачивают и инкубируют при комнатной температуре.

8.8. Учет реакции проводят через 16 - 24 ч инкубирования посевов.

В опытных пробах и контроле титра фага подсчитывают число негативных колоний во всех чашках. Негативные колонии - округлые, хорошо заметные на фоне бактериального роста, прозрачные участки, образующиеся в результате лизиса бактерий.

При учете результатов сравнивают количество негативных колоний на чашках соответствующих разведений.

8.9. Результаты реакции оценивают по увеличению титра бактериофага (количества негативных колоний):

увеличение количества негативных колоний в опытной пробе по отношению к контролю в 5 и более раз (хотя бы по одному из разведений) оценивается как положительный результат, менее чем в 5 раз - отрицательный;

сплошной лизис или лизис с островками оценивается как положительный результат.

8.10. При получении положительного результата РНФ дают заключение, что в исследуемом материале (пробе) обнаружены бактерии рода Listeria.

Биологические исследования (постановку биопроб на мышах) выделенных культур и их серологическую диагностику в реакции агглютинации проводят в ходе противоэпидемических мероприятий и при эпидрасследовании заболеваний в соответствии с Методическими рекомендациями "Лабораторная диагностика листериоза животных и людей, меры борьбы и профилактики". М., 1987 (утв. 04.09.86) [16].

Исследования пищевых продуктов на наличие Listeria monocytogenes проводят в соответствии с СанПиН 1.2.731-99 "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности и гельминтами".

1. Федеральный закон "О санитарно - эпидемиологическом благополучии населения" от 30 марта 1999 г. N 52-ФЗ.

2. Положение о государственной санитарно - эпидемиологической службе Российской Федерации, утвержденное Постановлением Правительства Российской Федерации от 24 июля 2000 г. N 554.

3. Положение о государственном санитарно - эпидемиологическом нормировании, утвержденное Постановлением Правительства Российской Федерации от 24 июля 2000 г. N 554.

4. СанПиН 2.3.2.1078-01 "Гигиенические требования к безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов".

5. ГОСТ 26668-85 "Продукты пищевые и вкусовые. Методы отбора проб для микробиологических исследований".

6. ГОСТ 26669-85 "Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов".

7. ГОСТ 26670-91 "Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов".

8. ГОСТ 10444.1-84 "Консервы. Приготовление растворов, красок, индикаторов, питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе".

9. ГОСТ 9225-84 "Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического анализа".

10. ГОСТ 9792-73 "Колбасные изделия и продукты из свинины, баранины, говядины и мяса других видов убойных животных и птиц. Правила приемки и методы отбора проб".

11. ГОСТ 9958-81 "Изделия колбасные и продукты из мяса. Методы бактериологического анализа".

12. ГОСТ 21237-75 "Мясо. Методы микробиологического анализа".

13. ГОСТ 4288-76 "Изделия кулинарные и полуфабрикаты из рубленого мяса. Правила приемки и методы испытания".

14. ГОСТ 7631-85 "Рыба, морские млекопитающие, морские беспозвоночные и продукты их переработки. Правила приемки, органолептические методы оценки качества, методы отбора проб для лабораторных испытаний".

15. МУК 4.2.590-96 "Бактериологические исследования с использованием микробиологического экспресс - анализатора "Бак Трак 4100" / Минздрав России. М., 1997.

16. Методические рекомендации "Лабораторная диагностика листериоза животных и людей, меры борьбы и профилактики" (утв. Минздравом СССР 04.09.86).

17. "Инструкция по санитарно - микробиологическому контролю тушек, мяса птицы, птицепродуктов, яиц и яйцепродуктов на птицеводческих и птицеперерабатывающих предприятиях" (утв. Главветупром; согл. зам. Главного государственного санитарного врача СССР 30.08.90).

18. СанПиН 2.3.4.050-96 "Производство и реализация рыбной продукции".

19. СанПиН 2.3.4.545-96 "Производство хлеба, хлебобулочных и кондитерских изделий".

20. СанПин 2.3.4.551-96 "Производство молока и молочных продуктов".

21. СанПиН 42-123-4423-87 "Нормативы и методы микробиологического контроля продуктов детского питания, изготовленных на молочных кухнях системы здравоохранения".

22. СанПиН 1.2.731-99 "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности и гельминтами".

23. СанПиН 2.3.6.1066-01 "Санитарно - эпидемиологические требования к организации торговли и обороту в них продовольственного сырья и пищевых продуктов".

24. "Инструкция по порядку и периодичности контроля за содержанием микробиологических и химических загрязнителей в молоке и молочных продуктах на предприятиях молочной промышленности" (утв. Минсельхозпродом России, согл. Госкомсанэпиднадзором России 29.12.95).

25. "Санитарные правила для предприятий пищеконцентратной промышленности" (утв. Минздравом СССР 01.03.76).

26. "Ветеринарно-санитарные правила для предприятий (цехов) переработки птицы и производства яйцепродуктов" (утв. Минздравом СССР 06.05.87).

27. "Инструкция по порядку и периодичности контроля за содержанием микробиологических и химических загрязнителей в мясе, птице, яйцах и продуктах их переработки" (утв. Минсельхозпромом России; согл. Минздравом России 27.06.00).

28. "Инструкция по микробиологическому контролю производства мороженого" (утв. ТК 186 по стандартизации (молоко и молочные продукты); согл. зам. Главного государственного санитарного врача России 10.03.93).

29. "Инструкция по санитарно - бактериологическому контролю производства маргарина и майонеза на предприятиях маргариновой промышленности" (утв. Госагропромом СССР 21.11.88).

30. "Порядок санитарно - микробиологического контроля при производстве мяса и мясных продуктов" (утв. Минсельхозпромом России 15.12.95).

31. "Инструкция по микробиологическому контролю производства высокостойких безалкогольных напитков. ИК 10-5031536-105-91" (утв. Госагропромом СССР; согл. Минздравом СССР 28.06.91).

32. "Инструкция по микробиологическому контролю быстрозамороженной плодоовощной продукции" (утв. Госагропромом СССР; согл. Минздравом СССР 29.09.89).

33. МУК 4.2.577-96 "Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов".