"МУК 4.1.770-99. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Количественное определение формальдегида в крови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Минздравом России 06.07.1999)

1. Разработаны под редакцией академика РАЕН, д.м.н., проф. Зайцевой Н.В., к.б.н. Улановой Т.С., к.б.н. Нурисламовой Т.В., Карнажицкой Т.Д., Суетиной Г.Н., Поповой Н.В., Митрофановой В.М., Плаховой Л.В., Рудаковой Е.А. (ПНИКИ детской экопатологии).

2. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 6 июля 1999 г.

Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТа 8.563-96 "Методики выполнения измерений", ГОСТа Р 1.5-92 "Общие требования к построению, изложению, оформлению и содержанию стандартов". Методика анализа аттестована и обеспечивает определение формальдегида в диапазоне концентраций 0,05 - 3,0 мкг/куб. см.

Содержание формальдегида в крови контрольной группы - мкг/куб. см.

Методика обеспечивает выполнение измерений с суммарной погрешностью результата измерений 20,0% при доверительной вероятности 0,95.

Методика основана на предварительном переводе формальдегида в 2,4-динитрофенилгидразон формальдегида, экстракции продукта дериватизации из биологического материала гексаном, упаривании гексанового экстракта, растворении упаренного остатка в ацетонитриле и анализе на жидкостном хроматографе.

Измерение концентрации формальдегида выполняют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием УФ-детектора.

Определению не мешают метанол, этанол, уксусный альдегид, ацетон, муравьиная кислота и другие карбонильные соединения.

Длительность анализа, включая подготовку пробы, - 50 мин.

При выполнении анализа применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, материалы и реактивы. Допускается применение других типов средств измерений, вспомогательного оборудования и химреактивов с аналогичными метрологическими характеристиками.

Помещение для проведения измерений должно соответствовать требованиям "Пожарных норм проектирования зданий и сооружений" (СНиП ПА-5-700) и "Санитарных норм проектирования промышленных предприятий" (СН 245-71) и СНиП-74.

При выполнении работ должны быть соблюдены меры противопожарной безопасности в соответствии с требованиями ГОСТа 12.1.004-85 и правила техники безопасности в соответствии с ГОСТом 12.1.007-76.

При работе необходимо соблюдать "Правила по технике безопасности и производственной санитарии при работе в химических лабораториях", утверждены МЗ СССР 20.12.82 (М.,1981), и "Правила устройства и безопасной эксплуатации сосудов, работающих под давлением", утверждены Госгортехнадзором СССР 27.11.87 (М.: Недра, 1989).

При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТу 12.1.005-88.

При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТом 12.1.019-79 и инструкцией по эксплуатации прибора.

К выполнению хроматографических измерений биологических проб допускаются лица, прошедшие обучение работе на жидкостном хроматографе.

При подготовке проб к анализу и приготовлении растворов соблюдают следующие условия:

- температура воздуха (20 +/- 10) °С;

- атмосферное давление 630 - 800 мм рт. ст.;

- влажность воздуха - не более 80% при температуре 25 °С.

Выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендуемых технической документацией по прибору.

Перед выполнением измерений проводят следующие работы: подготовка посуды и растворителей, приготовление растворов, подготовка хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики.

Используемую посуду необходимо тщательно вымыть хромовой смесью, тщательно ополоснуть водопроводной и дистиллированной водой и просушить при температуре 120 °С.

Хромовая смесь. В термостойкий стакан вместимостью 2 куб. дм насыпают 50 г хромовокислого калия, осторожно приливают по палочке частями, тщательно перемешивая, 1 куб. дм концентрированной серной кислоты.

Элюент для хроматографии. 50 куб. см очищенного ацетонитрила смешивают с 50 куб. см дистиллированной воды. Подвижную фазу фильтруют через воронку Шотта (пор 16) и дегазируют барботированием гелия или азота в течение 5 - 10 мин. со скоростью 50 - 60 куб. об./мин.

Соляная кислота, 2 моль/куб. дм. 163,0 куб. см концентрированной HCl (плотность 1,19 г/куб. см) вносят в мерную колбу вместимостью 1 куб. дм, доводят объем до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивают.

2,4-динитрофенилгидразин, 0,2%-ный раствор в 2М соляной кислоте. 0,2 г 2,4-динитрофенилгидразина вносят в мерную колбу вместимостью 100 куб. см и доводят до метки 2М раствором соляной кислоты.

Исходный раствор формальдегида для калибровки (раствор А). 1 куб. см ГСО формальдегида с концентрацией 1,0 мг/куб. см переносят в мерную колбу вместимостью 100 куб. см и доводят дистиллированной водой до метки. Срок хранения раствора - 36 ч.

Рабочий раствор для градуировки УФ-детектора. В мерную колбу вместимостью 100 куб. см вносят 10 куб. см раствора А и доводят дистиллированной водой до метки (раствор Б). Срок хранения раствора - 36 ч.

Идентификация хроматографического пика 2,4-динитрофенилгидразона формальдегида. Готовят раствор 2,4-динитрофенилгидразона формальдегида в ацетонитриле с концентрацией 0,01 - 0,02 мг/куб. см, вводят в колонку хроматографа 1 - 2 куб. мм раствора. Снимают хроматограмму в условиях хроматографического анализа и определяют время удерживания 2,4-динитрофенилгидразона формальдегида.

Колонку устанавливают на хроматограф и подают элюирующую жидкость (ацетонитрил:вода = 1:1) со скоростью 1 куб. см/мин. до установления равновесия колонки, которое определяют по стабильности нулевой линии детектора.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика на хроматограмме от концентрации формальдегида в крови, устанавливают по пяти сериям растворов для градуировки. Каждую серию, состоящую из шести растворов, готовят из растворов А и Б.

Растворы для установления градуировочной характеристики готовят в мерных колбах вместимостью 50 куб. см. Для этого в каждую колбу вносят раствор А (или раствор Б) в соответствии с таблицей, доводят объем до метки цельной кровью, не содержащей формальдегид, и тщательно перемешивают. Растворы готовят непосредственно перед определением.

2 куб. см каждого рабочего раствора помещают в делительную воронку, добавляют 40 куб. см дистиллированной воды, 2 куб. см 0,2%-ного раствора 2,4-динитрофенилгидразина в 2М соляной кислоте, 2 капли концентрированной соляной кислоты, 5 куб. см гексана и экстрагируют 15 мин. После расслоения гексана и крови верхний слой (гексановый) переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют 1 - 2 мин. со скоростью 2750 об./мин., затем 1,5 куб. см гексана переносят в бюкс и выпаривают досуха под ИК-лампой. Высушенный остаток растворяют в 0,4 куб. см ацетонитрила и вводят в хроматограф аликвотную часть (10 мкл). Проводят по пять параллельных вводов обработанных экстрактов каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях:

По средним для каждой точки значениям аналитического сигнала (площади пика) строят градуировочную характеристику S = f (С), где: S - площадь пика, кв. мм (или усл. ед.); С - концентрация градуировочного раствора, мкг/куб. см. По установленной градуировочной характеристике и по значению аналитического сигнала пробы определяют концентрацию формальдегида в исследуемом образце.

Для отбора проб крови используют чистую посуду объемом 10 куб. см. Кровь отбирают из вены в количестве 2 кв. см. Срок хранения пробы крови в холодильнике - не более 48 ч.

2 куб. см анализируемой пробы помещают в делительную воронку, добавляют 40 куб. см дистиллированной воды, 2,0 куб. см 0,2%-ного раствора 2,4-динитрофенилгидразина в 2М соляной кислоте, 2 капли концентрированной соляной кислоты, 5 куб. см гексана и экстрагируют 15 мин. После расслоения жидкостей верхний слой (гексановый) переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют 1 - 2 мин. со скоростью 2750 об./мин., затем 1,5 куб. см гексана переносят в бюкс и выпаривают досуха под ИК-лампой. Высушенный остаток растворяют в 0,4 куб. см ацетонитрила и вводят в хроматограф аликвотную часть (10 куб. мм). Анализ проводят при вышеуказанных условиях работы хроматографа. По установленной градуировочной характеристике и по значению аналитического сигнала пробы определяют концентрацию формальдегида в исследуемом образце.

Вычисляют значение площади хроматографического пика 2,4-динитрофенилгидразона формальдегида по формуле:

где:

h - высота пика, мм;

L - ширина пика на половине высоты, мм.

Из градуировочных характеристик по значению площади хроматографического пика 2,4-динитрофенилгидразона формальдегида находят массовую концентрацию формальдегида в крови, мкг/куб. см.

Внутренний оперативный контроль качества результатов контрольного химического анализа (сходимость, воспроизводимость, точность) осуществляют с целью получения оперативной информации о качестве анализов и принятия при необходимости оперативных мер по его повышению (МИ 2335-95).

Периодичность контроля сходимости измерений зависит от количества рабочих измерений (2 параллельные пробы). Отбирают 2 пробы мочи и каждую из них анализируют в точном соответствии с прописью методики.

Результаты признаются удовлетворительными, если выполняется условие:

Периодичность контроля погрешности измерений зависит от количества рабочих измерений за контролируемый период и определяется планами контроля.

Образцами для контроля являются представительные пробы биосред, к которым делаются добавки в виде раствора. Отбирают 2 пробы и к одной из них делают добавку в виде раствора таким образом, чтобы их содержание увеличилось по сравнению с исходным на 50 - 150%. Каждую пробу анализируют в точном соответствии с прописью методики и получают результат анализа исходной рабочей пробы X и рабочей пробы с добавкой X'. Результаты анализа исходной рабочей пробы X и рабочей пробы с добавкой X' получают не по возможности, а в одинаковых условиях, т.е. их получает один аналитик с использованием одного набора мерной посуды, одной партии реактивов и т.д.

Результаты контроля признаются удовлетворительными, если выполняется условие:

При превышении оперативного контроля погрешности эксперимент повторяют. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам контроля, и их устраняют.