"МУК 4.1.3572-19. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методика измерений массовой концентрации 6-[O-(1,1-диметилэтил)-D-серин]-10-деглицинамидлютеинизирующего гормона рилизинг фактора (свиного) 2-(аминокарбонил)гидразида ацетата (гозерелина ацетат) в воздухе рабочей зоны методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 28.10.2019)

1. Подготовлены ФГБНУ "Научно-исследовательский институт медицины труда") (Л.Г. Макеева, Н.С. Горячев, Н.Л. Полуэктова, Е.Н. Грицун).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 18 октября 2019 г.

3. Введены впервые.

Разработаны сотрудниками ООО "Алгама" (Н.П. Сергеюк), АО "Всесоюзный научный центр по безопасности биологически активных веществ" (М.И. Голубева, Л.И. Крымова), ФГБУ "Научный центр биомедицинских технологий ФМБА" (А.Ю. Савченко), ООО "ФНЦ "ИннофармаТех" (И.Е. Шохин), АНО "Международная ассоциация клинических фармакологов" (Г.В. Раменская).

Свидетельство о государственной метрологической аттестации N 205-16/RA.RU.311787-2016/2017.

1.1. Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для измерения массовой концентрации гозерелина ацетата в воздухе рабочей зоны в диапазоне массовых концентраций 0,001 - 0,008 мг/м³.

1.2. Методические указания по измерению массовых концентраций вредных веществ в воздухе рабочей зоны предназначены для лабораторий Роспотребнадзора, санитарных лабораторий промышленных предприятий при осуществлении контроля за содержанием вредных веществ в воздухе рабочей зоны, а также научных и других организаций, осуществляющих исследования содержания вредных веществ в воздухе рабочей зоны.

1.3. Методические указания носят рекомендательный характер.

2.1. Физико-химические свойства гозерелина.

Структурная формула:

Эмпирическая формула: C₆₁H₈₈N₁₈O₁₆ или C₅₉H₈₄N₁₈O₁₄·C₂H₄O₂.

Молекулярная масса: 1329,5.

Регистрационный номер CAS: 145781-92-6.

Гозерелина ацетат - белый или почти белый с кремовым оттенком кристаллический порошок с температурой плавления более 190 °C (с разложением), трудно растворим в воде (20 мг/см³), растворим в диметилсульфоксиде, диметилформамиде, легко растворим в ледяной уксусной кислоте, практически нерастворим в ацетоне, хлороформе, эфире.

Агрегатное состояние в воздухе - аэрозоль.

2.2. Токсикологическая характеристика гозерелина:

- противоопухолевое гормональное средство, синтетический дека-пептид, агонист гонадотропин рилизинг-гормона, выпускается в виде ацетата, обладает высокой фармакотерапевтической активностью;

- умеренно опасен при введении внутрь, обладает функциональной кумуляцией, оказывает выраженное влияние на репродуктивную систему (антигонадотропное, антиандрогенное и антиэстрогенное действие), вызывает эффект "химической или фармакологической кастрации";

- контроль гозерелина ацетата в воздухе рабочей зоны следует проводить на уровне чувствительности метода не менее 0,001 мг/м³.

3.1. При соблюдении всех регламентированных условий и проведении анализа в точном соответствии с данной методикой при выполнении измерений массовой концентрации гозерелина ацетата метрологические характеристики не превышают значений, представленных в табл. 1 (при доверительной вероятности P = 0,95).

4.1. Измерение массовой концентрации гозерелина ацетата выполняют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с ультрафиолетовым детектированием. Метод основан на разделении гозерелина ацетата и других компонентов анализируемой смеси на хроматографической колонке, заполненной сорбентом, с последующей регистрацией гозерелина ацетата с помощью ультрафиолетового детектора. Сигнал детектора прямо пропорционален концентрации гозерелина ацетата в анализируемой пробе.

Измерение проводят при длине волны 280 нм.

Отбор проб проводят с концентрированием на аналитические аэрозольные фильтры.

Минимально определяемое содержание гозерелина ацетата в анализируемом объеме пробы - 0,02 мкг.

Нижний предел измерения массовой концентрации гозерелина ацетата в воздухе - 0,001 мг/м³ (при отборе 2 000 дм³ воздуха).

Метод специфичен в условиях приготовления лекарственных форм на основе гозерелина ацетата. Измерению не мешают вспомогательные вещества: DL-молочной и гликолевой кислот сополимер (1:1).

Примечание. Допускается использование средств измерений с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией.

Примечание. Допускается применение оборудования, вспомогательных устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

6.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работы с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами, по ГОСТ 12.1.007, ГОСТ 12.1.005.

6.2. При проведении анализов горючих и вредных веществ должны соблюдаться требования противопожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004. Должны быть в наличии средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Необходимо провести обучение работающих правилам безопасности труда согласно ГОСТ 12.0.004.

6.3. При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019 и инструкцией по эксплуатации прибора.

6.4. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать гигиенических нормативов <5>.

--------------------------------

<5> ГН 2.2.5.3532-18 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны"; ГН 2.2.5.2308-07 "Ориентировочные безопасные уровни воздействия (ОБУВ) вредных веществ в воздухе рабочей зоны".

7.1. Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы на спектрофотометре, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

8.2. Выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

9.1. Перед выполнением измерений проводят следующие работы: приготовление растворов, подготовка жидкостного хроматографа, установление градуировочной характеристики, отбор проб воздуха.

9.2. Приготовление основного раствора гозерелина ацетата: основной раствор гозерелина ацетата с массовой концентрацией 500 мкг/см³ готовят растворением 0,0500 +/- 0,0002 г гозерелина ацетата в смеси для растворения: метиловый спирт и вода особо чистая с объемным соотношением (55:45) в мерной колбе вместимостью 100 см³. Срок хранения раствора - в течение двух недель в хорошо укупоренной таре, в защищенном от света месте, в холодильнике.

9.3. Приготовление рабочего раствора гозерелина ацетата N 1: рабочий раствор гозерелина ацетата N 1 с массовой концентрацией 100,0 мкг/см³ готовят разбавлением 10,0 см³ основного раствора гозерелина ацетата смесью для растворения: метиловый спирт и вода особо чистая с объемным соотношением (55:45) в мерной колбе вместимостью 50 см³. Срок хранения раствора - в течение недели в хорошо укупоренной таре, в защищенном от света месте, в холодильнике.

9.4. Приготовление рабочего раствора гозерелина ацетата N 2: рабочий раствор гозерелина ацетата N 2 с массовой концентрацией 20,0 мкг/см³ готовят разбавлением 10,0 см³ рабочего раствора гозерелина ацетата N 1 смесью для растворения: метиловый спирт и вода особо чистая с объемным соотношением (55:45) в мерной колбе вместимостью 50 см³. Срок хранения раствора - в течение недели в хорошо укупоренной таре, в защищенном от света месте, в холодильнике.

9.5. Приготовление смеси для растворения: смесь спирта метилового и воды особо чистой с объемным соотношением (55:45): в мерной колбе вместимостью 1000 см³ смешивают 550 см³ спирта метилового и 450 см³ воды особо чистой с объемным соотношением (55:45). Срок хранения раствора - в течение месяца в холодильнике.

9.6. Приготовление 0,02 М фосфатного буферного раствора натрия фосфорнокислого двузамещенного (pH 2,5): навеску натрия фосфорнокислого двузамещенного в количестве 2,84 г помещают в мерную колбу вместимостью 1000 см³ и растворяют в 1000 см³ воды особо чистой. Затем по каплям добавляют концентрированную ортофосфорную кислоту, доводят pH раствора до 2,5 (pH устанавливают с помощью иономера). Срок хранения раствора - 1 неделя в хорошо укупоренной таре в защищенном от света месте.

9.7. Приготовление подвижной фазы: смесь ацетонитрила и 0,02 М фосфатного буферного раствора натрия фосфорнокислого двузамещенного (pH 2,5) с объемным соотношением (25:75): в мерной колбе вместимостью 1 000 см³ смешивают 250 см³ ацетонитрила и 750 см³ 0,02 М фосфатного буферного раствора натрия фосфорнокислого двузамещенного (pH 2,5). Перед использованием подвижную фазу фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм и дегазируют. Срок хранения раствора - 2 недели в хорошо укупоренной таре, в защищенном от света месте.

9.8. Подготовку хроматографа проводят в соответствии с руководством по его эксплуатации.

9.9. Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пиков (приборные единицы) от содержания гозерелина ацетата в анализируемом объеме градуировочных растворов, устанавливают по методу абсолютной градуировки по шести сериям измерений по шести концентрациям вещества в каждой серии и контрольного раствора N 0 согласно табл. 2.

На аналитические аэрозольные фильтры, помещенные в бюксы, наносят пипеткой вместимостью 1 см³ объемы рабочего раствора гозерелина ацетата N 1 с массовой концентрацией 100,0 мкг/см³ и рабочего раствора гозерелина ацетата N 2 с массовой концентрацией 20,0 мкг/см³ в соответствии с табл. 2. Фильтры подсушивают при комнатной температуре и с помощью пипетки вместимостью 5,0 см³ приливают по 5,0 см³ смеси для растворения: спирт метиловый и вода особо чистая с объемным соотношением (55:45) и оставляют на 15 минут, периодически помешивая стеклянной палочкой для лучшего растворения вещества. Затем фильтры тщательно отжимают, растворы сливают в мерные пробирки вместимостью 10 см³. Фильтры повторно обрабатывают 5,0 см³ смеси для растворения: спирт метиловый и вода особо чистая с объемным соотношением (55:45) и оставляют на 15 минут, периодически помешивая стеклянной палочкой, затем фильтры тщательно отжимают и удаляют. Растворы сливают в те же пробирки и доводят объем до 10,0 см³ смесью для растворения: спирт метиловый и вода особо чистая с объемным соотношением (55:45). Далее растворы фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм в хроматографические виалы. Аналогично обрабатывают чистый аэрозольный фильтр (контрольный раствор).

Инжектируют в хроматограф по 0,1 см³ каждого из градуировочных растворов (табл. 2) с помощью микрошприца.

По полученным данным методом абсолютной градуировки строят градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (приборные единицы) от содержания гозерелина ацетата в анализируемом объеме градуировочных растворов (мкг).

9.10. Условия хроматографирования градуировочных растворов и анализируемых проб:

- подвижная фаза: смесь ацетонитрила и 0,02 М фосфатного буферного раствора натрия фосфорнокислого двузамещенного (pH 2,5) с объемным соотношением (25:75);

- время удерживания гозерелина ацетата не менее 7,0 +/- 0,2 мин.

9.11. Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят не реже 1 раза в три месяца, а также при смене реактивов или изменении условий анализа (после ремонта и поверки прибора). Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов. Один раз в год градуировочную характеристику устанавливают заново.

Для контроля стабильности используют вновь приготовленные градуировочные растворы с массовой концентрацией исследуемого вещества по п. 9.9 (соответствующих началу, середине и концу диапазона измерений) и анализируют в точном соответствии с прописью методики.

Градуировочную характеристику считают стабильной, если для каждого контрольного образца выполняется условие:

где S_изм, S_гр - значение площади пика (приборные единицы) гозерелина ацетата в образце для контроля, измеренное и найденное по градуировочной характеристике, соответственно;

K_гр - норматив контроля, , где

- границы относительной погрешности, % (табл. 1).

Если условие стабильности не выполняется только для одного образца, то выполняют повторное хроматографирование этого образца с целью исключения результата, содержащего грубую ошибку.

Если градуировочная характеристика не стабильна, условие (1) не выполняется для двух или более образцов градуировочных растворов, выясняют причины нестабильности и повторяют контроль стабильности с использованием других образцов (табл. 2) для установления градуировочной характеристики, предусмотренных методикой. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики ее устанавливают заново.

9.12. Отбор проб проводят с учетом требований ГОСТ 12.1.005 и приложения 9 к Р 2.2.2006-05.

Одновременно отбирают две пробы. При отборе проб фиксируется температура воздуха и атмосферное давление.

Воздух аспирируют через аналитический аэрозольный фильтр с площадью рабочей поверхности 20 см², помещенный в фильтродержатель, снабженный металлической сеткой. Для определения массовой концентрации гозерелина ацетата на уровне 0,001 мг/м³ отбирают не менее 2 000 дм³ воздуха в течение 15 минут.

Срок хранения отобранных проб в бюксах - в течение трех дней в холодильнике.

10.1. Аэрозольный фильтр с отобранной пробой помещают в бюкс, пипеткой вместимостью 5 см³ приливают 5 см³ смеси для растворения: спирт метиловый и вода особо чистая с объемным соотношением (55:45), периодически помешивая при этом стеклянной палочкой в течение 15 минут для лучшего растворения вещества. Затем фильтр тщательно отжимают, раствор сливают в мерную пробирку вместимостью 10 см³. Фильтр повторно обрабатывают 5 см³ смеси для растворения: спирт метиловый и вода особо чистая с объемным соотношением (55:45), оставляют на 15 минут, периодически помешивая при этом стеклянной палочкой, затем фильтр тщательно отжимают и удаляют. Раствор сливают в ту же пробирку, объем раствора доводят до 10 см³ смесью для растворения: спирт метиловый и вода особо чистая с объемным соотношением (55:45). Полученный раствор фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм в хроматографическую виалу.

Хроматографический анализ проб выполняют в тех же условиях, что и хроматографирование градуировочных растворов.

Регистрируют не менее двух хроматограмм для каждой анализируемой пробы, соблюдая все условия, требуемые для градуировки хроматографической системы.

Устанавливают содержание гозерелина ацетата (в мкг) в анализируемом объеме пробы по градуировочной характеристике (п. 9.9).

Примечание. Фильтрование анализируемых проб проводится для удаления нерастворимых в смеси для растворения - спирт метиловый и вода особо чистая с объемным соотношением (55:45) - вспомогательных веществ, входящих в состав лекарственных форм гозерелина ацетата.

11.1. Массовую концентрацию гозерелина ацетата в воздухе рабочей зоны C, мг/м³, вычисляют по формуле:

где а - содержание вещества в анализируемом объеме пробы, найденное по градуировочной характеристике, мкг;

B - общий объем пробы, см³;

б - анализируемый объем пробы, см³;

V₂₀ - объем воздуха, отобранный для анализа (дм³) и приведенный к стандартным условиям (прилож. 1 к настоящим методическим указаниям).

За результат измерений принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, если выполняется условие приемлемости:

где C₁, C₂ - результаты параллельных определений массовой концентрации гозерелина ацетата в воздухе, мг/м³;

r - значение предела повторяемости, % (табл. 1).

Если условие (3) не выполняется, выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и повторяют выполнение измерений в соответствии с требованиями методики.

12.1. Результат количественного химического анализа представляют в виде:

где - среднее арифметическое значение результатов n определений, признанных приемлемыми, мг/м³;

- границы относительной погрешности измерений, % (табл. 1).

Если полученный результат измерений ниже нижней (выше верхней) границы диапазона измерений, то производят следующую запись в журнале: "массовая концентрация гозерелина ацетата менее 0,001 мг/м³ (более 0,008 мг/м³)".

13.1. Проверку приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости проводят:

а) при возникновении спорных ситуаций между двумя лабораториями;

б) при проверке совместимости результатов измерений, полученных при сравнительных испытаниях (при проведении аккредитации лабораторий и инспекционного контроля).

Для проведения проверки приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости каждая лаборатория использует пробы, оставленные на хранение.

Приемлемость результатов измерений, полученных в двух лабораториях, оценивают сравнением разности этих результатов с критической разностью CD_0,95 по формуле:

где C_ср1, C_ср2 - средние значения массовой концентрации гозерелина ацетата, полученные в первой и второй лабораториях, мг/м³;

CD_0,95 - значение критической разности, % (табл. 1).

Если критическая разность не превышена, то приемлемы оба результата измерений, проводимых двумя лабораториями, и в качестве окончательного результата используют их среднее арифметическое значение. Если критическая разность превышена, то выполняют процедуры, изложенные в п. 5.3.3 ГОСТ Р ИСО 5725-6.

При разногласиях руководствуются п. 5.3.4 ГОСТ Р ИСО 5725-6.

13.2. Контроль качества результатов измерений в лаборатории при реализации методики осуществляют по ГОСТ Р ИСО 5725-6, используя контроль стабильности среднеквадратического (стандартного) отклонения повторяемости по п. 6.2.2 ГОСТ Р ИСО 5725-6, ГОСТ Р ИСО 5725-6 и показатель правильности по п. 6.2.4 ГОСТ Р ИСО 5725-6.

Рекомендуется устанавливать контролируемый период так, чтобы количество результатов контрольных измерений было от 20 до 30.

При неудовлетворительных результатах контроля, например, при превышении предела действия или регулярном превышении предела предупреждения, выясняют причины этих отклонений, в том числе проводят смену реактивов, проверяют работу оператора.

Приведение объема воздуха к стандартным условиям при температуре 293 К (20 °C) и атмосферном давлении 101,33 кПа (760 мм рт. ст.):

где V_t - объем воздуха, отобранный для анализа, дм³;

P - барометрическое давление, кПа (101,33 кПа - 760 мм рт. ст.);

t - температура воздуха в месте отбора пробы, °C.

Для удобства расчета V₂₀ следует пользоваться таблицей коэффициентов (прилож. 2 к настоящим методическим указаниям). Для приведения воздуха к стандартным условиям надо умножить V_t на соответствующий коэффициент.