"МУК 4.1.2676-10. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методика выполнения измерений остаточного содержания тиаклоприда в зеленой массе, семенах и масле рапса, ягодах и соке винограда методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 02.08.2010)

1. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 10.06.2010 N 1).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 2 августа 2010 г.

3. Введены впервые.

Название вещества по ИСО: Тиаклоприд.

Название вещества по ИЮПАК: (Z)-3-(6-хлор-3-пиридилметил)-1,3-тиазолидин-2-илиденцианамид.

Структурная формула (не приводится).

Область применения

Тиаклоприд - инсектицид нервно-паралитического действия, эффективно уничтожает тлю, цветоеда, минеров, трипсов, плодожорку, колорадского жука на хлопчатнике, табаке, картофеле, рисе, овощных культурах, цитрусовых, косточковых и семечковых плодовых в течение вегетационного периода.

Применяется в России в качестве инсектицида для обработки яблоневых садов при норме расхода до 200 г д.в./га и одно-, двукратной обработке за сезон.

При соблюдении всех регламентированных условий и проведении анализа в точном соответствии с данной методикой значение погрешности (и ее составляющих) результатов измерений не превышает значений, приведенных в табл. 1.

Метод основан на экстракции тиаклоприда из зеленой массы рапса и ягод винограда раствором водного ацетона, из семян и масла рапса раствором ацетонитрила, из сока винограда раствором хлористого метилена, очистке экстрактов, содержащих тиаклоприд, от коэкстрактивных компонентов перераспределением их в системе несмешивающихся растворителей, а также на колонке с силикагелем с последующим измерением содержания тиаклоприда в очищенных экстрактах на жидкостном хроматографе с ультрафиолетовым детектированием и обработкой хроматограмм методом абсолютной градуировки.

В предлагаемых условиях анализа метод специфичен.

Примечание. Допускается применение других средств измерений, вспомогательных устройств, реактивов и материалов с техническими и метрологическими характеристиками не хуже приведенных в разделе 4.

5.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работы с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.007-76, ГОСТ 12.1.005-88.

5.2. При проведении анализов горючих и вредных веществ соблюдают требования противопожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и должны быть в наличии средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-90.

5.3. При выполнении измерений с использованием хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцией по эксплуатации прибора.

5.4. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07.

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя с опытом работы на жидкостном хроматографе.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией "лаборант", имеющего опыт работы в химической лаборатории.

7.1. При выполнении измерений соблюдают следующие условия.

Условия приготовления растворов и подготовки проб к анализу:

- температура воздуха (20 +/- 5) °C;

- атмосферное давление (84 - 106) кПа;

- относительная влажность воздуха не более 80%.

7.2. Условия хроматографического анализа

Температура колонки: 27 °C.

Подвижная фаза: ацетонитрил-вода (45:55).

Скорость потока элюента: 0,5 куб. см/мин.

Рабочая длина волны: 242 нм.

Чувствительность детектора: 0,002 ед. абсорбции на шкалу.

Объем вводимой пробы: 5 куб. мм.

Время удерживания тиаклоприда: 5,7 мин. +/- 0,2 мин.

Линейный диапазон детектирования: 0,1 - 1,0 нг.

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей, приготовление растворов, подвижной фазы для ВЭЖХ, кондиционирование хроматографической колонки, градуировка хроматографа, подготовка колонки с силикагелем.

8.1.1. Очистка ацетонитрила

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора не менее 1 часа, после чего перегоняют. Перед применением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом натрия.

8.1.2. Очистка н-гексана

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до прекращения окрашивания ее в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над поташом.

8.1.3. Очистка ацетона

8.1.4. Очистка силикагеля

Силикагель 60 (0,063 - 0,2 мм) для колоночной хроматографии встряхивают с двойным объемом очищенного ацетона и затем фильтруют на воронке Бюхнера через бумажный фильтр. Силикагель на фильтре промывают 1,5 объемом ацетона и затем высушивают при температуре 130° в течение 5 часов.

8.1.5. Приготовление раствора ацетон-вода (9:1 по объему)

В мерный цилиндр вместимостью 500 куб. см помещают 50 куб. см бидистиллированной воды, а затем доводят объем раствора до метки ацетоном, подготовленным по 8.1.3.

Срок хранения раствора - 1 неделя.

8.1.6. Приготовление раствора ацетонитрил-вода (9:1 по объему)

В мерный цилиндр вместимостью 500 куб. см помещают 50 куб. см бидистиллированной воды, а затем доводят объем раствора до метки ацетонитрилом, подготовленным по 8.1.1.

Срок хранения раствора - 3 недели.

8.1.7. Приготовление насыщенного раствора хлорида натрия

В коническую колбу вместимостью 200 куб. см вносят навеску (50 +/- 2) г хлорида натрия, приливают (100 +/- 2) куб. см бидистиллированной воды, перемешивают в течение 5 мин., полученный раствор фильтруют. Фильтрат является насыщенным раствором хлорида натрия. Срок годности раствора - 1 неделя.

Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 8 - 10 мм уплотняют тампоном из стекловаты, медленно выливают в колонку (при открытом кране) суспензию 2 г силикагеля в 20 куб. см смеси гексан-ацетон (8:2, по объему). Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 0,5 см. Колонку промывают 30 куб. см смеси гексан-ацетон (8:2, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в секунду, после чего она готова к работе.

При отработке методики или поступлении новой партии силикагеля проводят определение объема элюента, необходимого для полного вымывания тиаклоприда из колонки с силикагелем.

В круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 0,1 куб. см градуировочного раствора N 1 тиаклоприда с массовой концентрацией 10 мкг/куб. см в ацетонитриле и отдувают растворитель током азота. Остаток растворяют в 0,6 куб. см ацетона, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., добавляют 2,4 куб. см гексана, перемешивают и вновь помещают в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на колонку с силикагелем, подготовленную по 8.2. Промывают колонку 50 куб. см смеси гексан-ацетон (8:2, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Затем колонку промывают 50 куб. см смеси гексан-ацетон (7:3, по объему), отбирая последовательно по 5 куб. см раствора. Каждую фракцию упаривают, остатки растворяют в 1 куб. см ацетонитрила, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., вносят 1 куб. см подвижной фазы, подготовленной по 8.4, перемешивают, а затем анализируют на содержание тиаклоприда. Условия хроматографирования - в соответствии с 7.2.

По результатам обнаружения тиаклоприда в каждой из фракций определяют объем смеси гексан-ацетон (7:3, по объему), необходимый для полного вымывания тиаклоприда из колонки.

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 450 куб. см ацетонитрила, 550 куб. см деионизованной воды, раствор перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр, дегазируют.

Хроматографическую колонку Symmetry C18 устанавливают в термостат хроматографа и стабилизируют при температуре 27 °C и скорости потока подвижной фазой 0,5 куб. см/мин. не менее часа до установления стабильной базовой линии (дрейф базовой линии в течение 1 часа не более 5%, а уровень шумов не более 2% диапазона выходного сигнала на шкале измерений).

8.6.1. Исходный градуировочный раствор тиаклоприда с массовой концентрацией 100 мкг/куб. см

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают (0,010 +/- 0,0001) г тиаклоприда, растворяют в 40 - 50 куб. см ацетонитрила, доводят объем раствора ацетонитрилом до метки, тщательно перемешивают.

Раствор хранят в морозильной камере при температуре (-18) °C в течение 2-х месяцев.

8.6.2. Градуировочный раствор тиаклоприда с массовой концентрацией 10 мкг/куб. см (раствор N 1)

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 10 куб. см исходного градуировочного раствора тиаклоприда с массовой концентрацией 100 мкг/куб. см (8.6.1), разбавляют ацетонитрилом и доводят объем до метки. Этот раствор используют для приготовления градуировочных растворов N 2 - 5.

Градуировочный раствор N 1 хранят в морозильной камере при температуре не выше (-18) °C в течение месяца.

8.6.3. Градуировочные растворы тиаклоприда с массовой концентрацией (0,02 - 0,2) мкг/куб. см (растворы N 2 - 5)

В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают 0,2, 0,4, 1,0 и 2,0 куб. см градуировочного раствора тиаклоприда с массовой концентрацией 10 мкг/куб. см (8.6.2), доводят объем до метки подвижной фазой, приготовленной по 8.4, тщательно перемешивают, получают градуировочные растворы N 2 - 5 с массовой концентрацией тиаклоприда 0,02, 0,04, 0,1 и 0,2 мкг/куб. см, соответственно.

Растворы готовят непосредственно перед использованием.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (мкВ x с) от массовой концентрации тиаклоприда в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной градуировки по 4 градуировочным растворам.

В инжектор хроматографа вводят по 5 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют при условиях 7.2. Каждый раствор хроматографируют дважды. Расхождение между параллельными определениями не должно превышать предел повторяемости r.

По полученным данным строят градуировочную характеристику.

Контроль стабильности градуировки проводят не реже 1 раза в три месяца, а также при смене реактивов или изменении условий анализа.

Для контроля стабильности используют вновь приготовленные градуировочные растворы с массовой концентрацией исследуемого вещества в начале, середине и в конце диапазона измерений, которые анализируют в точном соответствии с методикой.

Градуировочную характеристику считают стабильной, если для каждого контрольного образца выполняется условие (1)

Если условие стабильности не выполняется только для одного образца, то повторно анализируют этот образец для исключения результата, содержащего грубую ошибку.

Если градуировка нестабильна, выясняют причины нестабильности и повторяют контроль стабильности с использованием других образцов для градуировки, предусмотренных методикой. При повторном обнаружении нестабильности градуировки прибор градуируют заново.

Отбор проб производят в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79) и правилами, определенными ГОСТ 10851-86 "Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб", ГОСТ 8988-77 "Масло рапсовое. ТУ", ГОСТ 25896-83 "Виноград свежий столовый", ГОСТ 25892-83Е "Сок виноградный. ТУ".

Пробы зеленой массы и ягод хранят в полиэтиленовой таре в холодильнике не более 1 дня; для длительного хранения пробы замораживают и хранят в морозильной камере при температуре (-18) °C. Пробы семян подсушивают до влажности (в соответствии ГОСТ 10852-86) и хранят в бумажных или тканевых мешочках в хорошо проветриваемом шкафу. Масло хранят в плотно закрытой стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике при температуре (0 - 4) °C. В некоторых случаях масло получают из семян экстракцией органическими неполярными растворителями. Сок получают из ягод непосредственно перед проведением анализа. Перед анализом ягоды измельчают, семена размалывают на мельнице, зеленую массу измельчают ножницами.

9.1.1. Экстракция тиаклоприда из образцов зеленой массы

Образец измельченной ткани массой 20 г помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 куб. см, добавляют 100 куб. см смеси ацетон-вода (9:1, по объему), перемешивают и колбу помещают на встряхиватель на 30 минут. Суспензию фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу Бунзена вместимостью 250 куб. см. Растительный материал повторно экстрагируют 50 куб. см указанной выше смеси в течение 30 минут при встряхивании и суспензию фильтруют. Аликвоту объединенного фильтрата, эквивалентную 2 г растительной ткани, переносят в круглодонную колбу вместимостью 50 куб. см и упаривают до водного остатка (~ 1 куб. см) на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °C. К водному остатку добавляют 30 куб. см насыщенного раствора хлорида натрия и проводят очистку экстракта по 9.2.

9.1.2. Экстракция тиаклоприда из семян

Навеску размолотых семян массой 20 г помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 куб. см, добавляют 100 куб. см смеси ацетонитрил-вода (9:1, по объему), перемешивают и колбу помещают на встряхиватель на 30 минут. Суспензию фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу Бунзена вместимостью 250 куб. см. Растительный материал повторно экстрагируют 50 куб. см указанной выше смеси в течение 30 минут при встряхивании и суспензию фильтруют. Аликвоту объединенного фильтрата, эквивалентную 2 г растительного материала, переносят в круглодонную колбу вместимостью 50 куб. см, добавляют 10 куб. см бидистиллированной воды и упаривают до водного остатка (~ 3 - 5 куб. см) на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °C. К водному остатку добавляют 30 куб. см насыщенного раствора хлорида натрия, раствор переносят в делительную воронку вместимостью 100 куб. см. В воронку вносят 20 куб. см гексана, интенсивно встряхивают в течение 2-х минут. После разделения фаз верхний гексановый слой отбрасывают, а водную фазу повторно обрабатывают 20 куб. см гексана. Дальнейшую очистку экстракта проводят по 9.2.

9.1.3. Экстракция тиаклоприда из масла

Образец масла массой 10 г вносят в делительную воронку вместимостью 100 куб. см, добавляют 30 куб. см ацетонитрила и содержимое интенсивно встряхивают в течение 2-х минут. После разделения фаз переносят ацетонитрильный слой в центрифужную пробирку, а маслянистый остаток еще дважды обрабатывают 25 куб. см ацетонитрила. Объединенный ацетонитрильный экстракт центрифугируют при 6000 об./мин. в течение 10 минут и супернатант декантируют. Аликвоту супернатанта, эквивалентную 2 г масла, переносят в круглодонную колбу вместимостью 50 куб. см, приливают 10 куб. см бидистиллированной воды и образец упаривают до водного остатка (~ 3 - 5 куб. см) на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °C. К водному остатку добавляют 30 куб. см насыщенного раствора хлорида натрия и раствор переносят в делительную воронку вместимостью 100 куб. см. В воронку приливают 20 куб. см гексана, интенсивно встряхивают в течение 2-х минут. После разделения фаз верхний гексановый слой отбрасывают, а водную фазу повторно обрабатывают 20 куб. см гексана. Далее проводят очистку экстракта по 9.2.

9.1.4. Экстракция тиаклоприда из ягод

Навеску измельченного растительного материала массой 20 г помещают в стакан гомогенизатора вместимостью 500 куб. см, приливают 100 куб. см смеси ацетон-вода (9:1, по объему) и гомогенизируют 3 минуты при 10000 об./мин. Суспензию фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу вместимостью 250 куб. см. Остаток на фильтре промывают 50 куб. см указанной выше смеси. Экстракт и промывную жидкость переносят в химический стакан вместимостью 500 куб. см, перемешивают, измеряют объем раствора и 1/10 его часть, эквивалентную 2 г образца, переносят в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. Раствор упаривают до водного остатка (~ 1 куб. см) на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °C. К водному остатку добавляют 30 куб. см насыщенного раствора хлорида натрия и проводят очистку экстракта по 9.2.

9.1.5. Экстракция тиаклоприда из сока

Навеску (10 г) свежевыжатого сока помещают в химический стакан вместимостью 100 куб. см, приливают 30 куб. см бидистиллированной воды, 60 куб. см насыщенного раствора хлорида натрия, перемешивают, измеряют объем раствора. Отбирают 1/5 объема раствора, эквивалентного 2 г образца, переносят в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. Дальнейшую очистку экстракта проводят по 9.2.

Водные экстракты, полученные по (9.1.1 - 9.1.5), переносят в делительную воронку вместимостью 100 куб. см, приливают 25 куб. см хлористого метилена, интенсивно встряхивают в течение 2-х минут. После разделения фаз органический слой фильтруют через слой безводного сульфата натрия в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. Операцию экстракции водной фазы повторяют еще дважды, используя по 20 куб. см хлористого метилена. Объединенную органическую фракцию, пропущенную через слой безводного сульфата натрия, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре 30 °C. Дальнейшую очистку экстракта проводят по 9.3.

Сухой остаток в круглодонной колбе, полученный по 9.2, растворяют в 0,6 куб. см ацетона, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., добавляют 2,4 куб. см гексана, перемешивают, вновь помещают в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на колонку, подготовленную по 8.2. Колбу обмывают 5 куб. см смеси гексан-ацетон (8:2, по объему), которые также наносят на колонку. Промывают колонку 40 куб. см смеси гексан-ацетон (8:2, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в секунду, элюат отбрасывают. Тиаклоприд элюируют с колонки 45 куб. см смеси гексан-ацетон (7:3, по объему), отбрасывая первые 5 куб. см элюата и собирая последующие 40 куб. см непосредственно в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. Раствор упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре 30 °C. Сухой остаток экстракта сока винограда растворяют в 1 куб. см, ягод винограда - в 2 куб. см, семян рапса - в 5 куб. см, зеленой массы и масла рапса - в 10 куб. см подвижной фазы для ВЭЖХ, подготовленной по 8.4, раствор помещают в ультразвуковую ванну на 1 минуту и анализируют на содержание тиаклоприда по 10.

Полнота извлечения тиаклоприда при проведении всех операций подготовки пробы не менее 83%.

10.1. В инжектор хроматографа вводят 5 куб. мм очищенного экстракта анализируемой пробы (9.1 - 9.3), анализируют при условиях 7.2 и регистрируют хроматограмму. Каждый экстракт хроматографируют дважды.

10.2. Для каждого образца зеленой массы, ягод винограда, сока винограда, семян рапса, масла рапса повторяют операции по 9.1 - 9.3, 10.1.

11.1. Для обработки результатов хроматографического анализа используют программу сбора и обработки хроматографической информации "МультиХром для Windows", версия 1.5х.

Альтернативная обработка результатов.

11.2. За результат измерений принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, если выполняется условие приемлемости (3).

Если условие (3) не выполняется, выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и повторяют выполнение измерений в соответствии с требованиями МВИ.

11.3. Результат анализа в документах, предусматривающих его использование, представляют в виде:

Экстракты, при хроматографировании которых получают аналитический сигнал тиаклоприда, превышающий аналитический сигнал, получаемый при хроматографировании градуировочного раствора с массовой концентрацией 0,2 мкг/куб. см, разбавляют подвижной фазой, но не более чем в 10 раз, и анализируют в соответствии с данной методикой. При расчете содержания тиаклоприда учитывают разбавление.

12.1. Проверку приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости проводят:

а) при возникновении спорных ситуаций между двумя лабораториями;

б) при проверке совместимости результатов измерений, полученных при сличительных испытаниях (при проведении аккредитации лабораторий и инспекционного контроля).

12.2. Для проведения проверки приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости каждая лаборатория использует пробы, оставленные на хранение.

Если критическая разность не превышена, то приемлемы оба результата измерений, проводимых двумя лабораториями, и в качестве окончательного результата используют их среднеарифметическое значение. Если критическая разность превышена, то выполняют процедуры, изложенные в ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 (5.3.3).

При разногласиях руководствуются ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 (5.3.4).

Контроль качества результатов измерений в лаборатории при реализации методики осуществляют по ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002, используя контроль стабильности среднеквадратического (стандартного) отклонения повторяемости по 6.2.2 ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 и показателя правильности по 6.2.4 ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002. Проверку стабильности осуществляют с применением контрольных карт Шухарта.

Периодичность контроля стабильности результатов выполнения измерений регламентируют в Руководстве по качеству лаборатории.

Рекомендуется устанавливать контролируемый период так, чтобы количество результатов контрольных измерений было от 20 до 30.

При неудовлетворительных результатах контроля, например при превышении предела действия или регулярном превышении предела предупреждения, выясняют причины этих отклонений, в том числе проводят смену реактивов, проверяют работу оператора.

ГНУ ВНИИ фитопатологии.