"МУК 4.1.2690-10. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методика выполнения измерений остаточного содержания спироксамина в ботве и корнеплодах сахарной свеклы методом капиллярной газожидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 02.08.2010)

1. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 10.06.2010 N 1).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 2 августа 2010 г.

3. Введены впервые.

Название вещества по ИСО: Спироксамин.

Название по ИЮПАК: 8-третбутил-1,4-диоксаспиро[4,5]декан-2-илметил-(этил)(пропил)амин.

Структурная формула (не приводится).

Область применения препарата

Спироксамин - системный фунгицид, обладающий защитным, лечебным и искореняющим эффектом. Эффективен против возбудителей мучнистой росы, ржавчины, септориоза и пятнистостей на зерновых злаках и оидиума на винограде. Используется главным образом в комбинациях с другими фунгицидами, особенно триазолами, для обработки вегетирующих растений зерновых злаков и сахарной свеклы, а также виноградников в дозах до 150 г д.в. на 1 га.

При соблюдении всех регламентированных условий и проведении анализа в точном соответствии с данной методикой значение погрешности (и ее составляющих) результатов измерений не превышает значений, приведенных в табл. 1.

Метод основан на экстракции спироксамина из ботвы и корнеплодов водным раствором ацетона, очистке экстрактов, содержащих спироксамин, от коэкстрактивных компонентов перераспределением в системе несмешивающихся растворителей, а также на колонке с оксидом алюминия с последующим измерением содержания спироксамина в очищенных экстрактах методом капиллярной газожидкостной хроматографии (ГЖХ) при программировании температуры с термоионным детектором (ТИД) и обработкой хроматограмм по сумме площадей двух пиков изомеров спироксамина методом абсолютной градуировки.

В предлагаемых условиях анализа метод специфичен.

Примечание. Допускается применение других средств измерений, вспомогательных устройств, реактивов и материалов с техническими и метрологическими характеристиками не хуже приведенных в разделе 4.

5.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работы с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.007-76, ГОСТ 12.1.005-88.

5.2. При проведении анализов горючих и вредных веществ соблюдают требования противопожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и должны быть в наличии средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-90.

5.3. При выполнении измерений с использованием хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцией по эксплуатации прибора.

5.4. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07.

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя с опытом работы на газовом хроматографе.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией "лаборант", имеющего опыт работы в химической лаборатории.

7.1. При выполнении измерений соблюдают следующие условия.

Условия приготовления растворов и подготовки проб к анализу:

- температура воздуха (20 +/- 5) °C;

- атмосферное давление (84 - 106) кПа;

- относительная влажность воздуха не более 80%.

7.2. Условия хроматографического анализа

Температура термостата испарителя 250 °C.

Температура детектора 300 °C.

Режим программирования температуры колонки:

начальная температура 150 °C (2 мин.);

скорость подъема температуры до 230 °C (6 мин.) 25 °C/мин.;

от 230 до 280 °C (5 мин.) скорость подъема температуры 20 °C/мин.

Расход газов:

газа-носителя (гелий) - 2,0 куб. см/мин.;

водорода к ТИД - 4,3 куб. см/мин.;

воздуха к ТИД: 175 куб. см/мин.

Деление потока: 1:2.

Объем вводимой пробы: 1 куб. мм.

Время удерживания спироксамина: 7,54 мин. +/- 0,2 мин. (изомер I) и 8,07 мин. +/- 0,2 мин. (изомер II).

Линейный диапазон детектирования: 0,1 - 1,0 нг.

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей, приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, градуировка хроматографа, подготовка колонки с оксидом алюминия.

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до прекращения окрашивания последней в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над поташом.

Приготовление раствора натрия углекислого с массовой долей 5%. Навеску (5 +/- 0,1) г натрия углекислого в конической колбе растворяют в 40 - 60 куб. см дистиллированной воды. Полученный раствор переносят в мерную колбу вместимостью 100 куб. см и доводят объем раствора до метки дистиллированной водой.

Срок хранения раствора 1 неделя.

Этилацетат промывают последовательно раствором натрия углекислого с массовой долей 5%, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над безводным карбонатом калия и перегоняют.

4 г NaOH помещают в мерную колбу вместимостью 1000 куб. см, добавляют 500 - 600 куб. см деионизованной воды, перемешивают до полного растворения вещества, охлаждают раствор до комнатной температуры, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают.

Срок хранения - 1 месяц.

Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 8 - 10 мм уплотняют тампоном из стекловаты, медленно выливают в колонку (при открытом кране) суспензию 10 г оксида алюминия нейтрального III степени активности в 15 куб. см гексана (оксид алюминия III степени активности по Брокману получают добавлением 6% воды к навеске оксида алюминия фирмы "Мерк" (Германия) I степени активности). Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку последовательно промывают 20 куб. см смеси гексан-этилацетат (8:2, по объему) и 20 куб. см гексана со скоростью 1 - 2 капли в секунду, после чего она готова к работе.

При отработке методики или поступлении новой партии оксида алюминия проводят определение объема элюента, необходимого для полного вымывания спироксамина из колонки с оксидом алюминия.

В круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 0,1 куб. см градуировочного раствора N 1 спироксамина с массовой концентрацией 10 мкг/куб. см в гексане (8.6.2). Отдувают растворитель током теплого воздуха, остаток растворяют в 3 куб. см гексана, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на колонку с оксидом алюминия, подготовленную по 8.3. Промывают колонку 50 куб. см гексана, затем 60 куб. см смеси гексан-этилацетат (8:2, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в секунду, отбирая последовательно по 10 куб. см элюента. Каждую фракцию упаривают, остатки растворяют в 2 куб. см гексана, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., а затем хроматографируют. Условия хроматографирования - в соответствии с 7.2.

По результатам обнаружения спироксамина в каждой из фракций определяют объем элюента, необходимый для полного вымывания спироксамина из колонки.

Капиллярную кварцевую колонку VF-5ms (типа SE-52) устанавливают в термостат хроматографа и, не подсоединяя к детектору, кондиционируют при температуре 280 °C и скорости газа-носителя 2 куб. см/мин. в течение 8 - 10 часов.

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают (0,010 +/- 0,0001) г спироксамина, растворяют в 40 - 50 куб. см гексана, доводят объем раствора гексаном до метки, тщательно перемешивают.

Раствор хранят в морозильной камере при температуре не выше -18 °C в течение 3-х месяцев.

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 10 куб. см исходного градуировочного раствора спироксамина с массовой концентрацией 100 мкг/куб. см (8.6.1), разбавляют гексаном, доводят объем раствора до метки. Этот раствор используют для приготовления градуировочных растворов N 2 - 5.

Раствор спироксамина хранят в морозильной камере при температуре не выше -18 °C в течение месяца.

В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают 1,0, 2,0, 5,0 и 10,0 куб. см градуировочного раствора N 1 спироксамина с массовой концентрацией 10 мкг/куб. см (8.6.2), доводят объем раствора до метки гексаном, тщательно перемешивают, получают градуировочные растворы N 2 - 5 с массовой концентрацией спироксамина 0,1, 0,2, 0,5 и 1,0 мкг/куб. см, соответственно.

Растворы готовят непосредственно перед использованием.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость суммарной площади пиков изомеров (мкВ х мин.) от массовой концентрации спироксамина в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной градуировки по 4 градуировочным растворам.

В инжектор хроматографа вводят по 1 куб. мм каждого градуировочного раствора (8.6.3) и анализируют при условиях хроматографирования по 7.2. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений. Расхождение между параллельными определениями не должно превышать предел повторяемости r.

По полученным данным строят градуировочную характеристику.

Контроль стабильности градуировки проводят не реже 1 раза в три месяца, а также при смене реактивов или изменении условий анализа.

Для контроля стабильности используют вновь приготовленные градуировочные растворы с массовой концентрацией исследуемого вещества в начале, середине и в конце диапазона измерений, которые анализируют в точном соответствии с методикой.

Градуировочную характеристику считают стабильной, если для каждого контрольного образца выполняется условие (1):

Если условие стабильности не выполняется только для одного образца, то повторно анализируют этот образец для исключения результата, содержащего грубую ошибку.

Если градуировка нестабильна, выясняют причины нестабильности и повторяют контроль стабильности с использованием других образцов для градуировки, предусмотренных методикой. При повторном обнаружении нестабильности градуировки прибор градуируют заново.

Отбор проб производят в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79) и правилами, определенными ГОСТ 17421-82 "Свекла сахарная для промышленной переработки. Требования при заготовках".

Пробы ботвы и корнеплодов сахарной свеклы хранят в холодильнике при температуре (0 - 4) °C не более суток; для длительного хранения пробы замораживают и хранят в полиэтиленовой таре в морозильнике при температуре -18 °C до анализа. Перед проведением анализа ботву и корнеплоды измельчают.

Приготовление водного раствора ацетона с объемной долей 70%. В мерную колбу вместимостью 500 куб. см помещают 350 куб. см ацетона и доводят объем раствора в колбе до метки дистиллированной водой.

Срок хранения раствора 1 неделя.

Навеску измельченного растительного материала массой 20 г помещают в стакан гомогенизатора вместимостью 500 куб. см, приливают 100 куб. см водного раствора ацетона с объемной долей 70% и гомогенизируют 3 мин. при 8000 об./мин. Гомогенат фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу Бунзена вместимостью 250 куб. см. Осадок на фильтре промывают 50 куб. см водного раствора ацетона с объемной долей 70%. Экстракт и промывную жидкость переносят в химический стакан, перемешивают, измеряют объем раствора и 1/4 его часть (эквивалентную 5 г образца) переносят в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. Далее проводят очистку экстракта по 9.2.

Приготовление насыщенного раствора хлорида натрия. В коническую колбу вместимостью 200 куб. см вносят навеску (50 +/- 2) г хлорида натрия, приливают (100 +/- 2) куб. см дистиллированной воды, перемешивают в течение 5 мин., полученный раствор фильтруют. Фильтрат является насыщенным раствором хлорида натрия. Срок годности раствора - 1 неделя.

Экстракт, полученный по 9.1 и помещенный в круглодонную колбу, упаривают на ротационном вакуумном испарителе до водного остатка (5 - 7 куб. см) при температуре не выше 40 °C. Водный остаток переносят в химический стакан вместимостью 100 куб. см, приливают 20 куб. см насыщенного раствора хлорида натрия, перемешивают и доводят pH раствора до 8,5 раствором гидроксида натрия с молярной концентрацией 0,1 моль/куб. дм, контролируя щелочность раствора с помощью иономера. Раствор переносят в делительную воронку вместимостью 100 куб. см, приливают 30 куб. см гексана и смесь встряхивают в течение 1 мин. После разделения фаз верхний органический слой фильтруют через слой безводного сульфата натрия в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. Операцию экстракции водной фазы повторяют еще дважды, используя 30 и 20 куб. см гексана. Объединенную органическую фазу, пропущенную через слой сульфата натрия, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре 30 °C. Дальнейшую очистку проводят по 9.3.

Сухой остаток в круглодонной колбе, полученный по 9.2, растворяют в 3 куб. см гексана, помещая в ультразвуковую ванну на 1 минуту. Раствор наносят на колонку, подготовленную по 8.3. Колбу обмывают 3 куб. см гексана, которые также наносят на колонку. Промывают колонку 30 куб. см гексана со скоростью 1 - 2 капли в секунду, элюат отбрасывают. Спироксамин элюируют с колонки 50 куб. см смеси гексан-этилацетат (8:2, по объему), собирая элюат непосредственно в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. Раствор упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре 40 °C. Сухие остатки экстрактов корнеплодов и ботвы растворяют соответственно в 2,5 и 5 куб. см гексана, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., и анализируют на содержание спироксамина по 10.

Полнота извлечения спироксамина при проведении всех операций подготовки пробы не менее 86%.

10.1. В испаритель хроматографа вводят 1 куб. мм очищенного экстракта анализируемой пробы (9.1 - 9.3), анализируют при условиях 7.2 и регистрируют хроматограмму. Каждый экстракт хроматографируют дважды. Каждый раз вычисляют сумму площадей пиков изомеров, затем рассчитывают их среднее значение.

10.2. Для каждого образца повторяют операции по 9.1 - 9.3, 10.1.

11.1. Для обработки результатов хроматографического анализа используют программу сбора и обработки хроматографической информации "GALAXIE".

Альтернативная обработка результатов.

Если условие (3) не выполняется, выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и повторяют выполнение измерений в соответствии с требованиями МВИ.

11.3. Результат анализа в документах, предусматривающих его использование, представляют в виде:

Экстракты, при хроматографировании которых получают аналитический сигнал спироксамина (сумма площадей пиков изомеров), превышающий аналитический сигнал, получаемый при хроматографировании градуировочного раствора с массовой концентрацией 1,0 мкг/куб. см, разбавляют гексаном, но не более чем в 10 раз, и анализируют в соответствии с данной методикой. При расчете содержания спироксамина учитывают разбавление.

12.1. Проверку приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости проводят:

а) при возникновении спорных ситуаций между двумя лабораториями;

б) при проверке совместимости результатов измерений, полученных при сличительных испытаниях (при проведении аккредитации лабораторий и инспекционного контроля).

12.2. Для проведения проверки приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости каждая лаборатория использует пробы, оставленные на хранение.

Если критическая разность не превышена, то приемлемы оба результата измерений, проводимых двумя лабораториями, и в качестве окончательного результата используют их среднеарифметическое значение. Если критическая разность превышена, то выполняют процедуры, изложенные в ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 (5.3.3).

При разногласиях руководствуются ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 (5.3.4).

Контроль качества результатов измерений в лаборатории при реализации методики осуществляют по ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002, используя контроль стабильности среднеквадратического (стандартного) отклонения повторяемости по 6.2.2 ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 и показателя правильности по 6.2.4 ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002. Проверку стабильности осуществляют с применением контрольных карт Шухарта.

Периодичность контроля стабильности результатов выполнения измерений регламентируют в Руководстве по качеству лаборатории.

Рекомендуется устанавливать контролируемый период так, чтобы количество результатов контрольных измерений было от 20 до 30.

При неудовлетворительных результатах контроля, например при превышении предела действия или регулярном превышении предела предупреждения, выясняют причины этих отклонений, в том числе проводят смену реактивов, проверяют работу оператора.

ГНУ ВНИИ фитопатологии, 143050, Московская обл., п/о Большие Вяземы.