"МУК 4.1.2677-10. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методика выполнения измерений остаточного содержания протиоконазола по метаболиту протиоконазол-дестио в семенах, масле и зеленой массе рапса методом капиллярной газожидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 02.08.2010)

1. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 10.06.2010 N 1).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 2 августа 2010 г.

3. Введены впервые.

Название вещества по ИСО: протиоконазол.

Название вещества по ИЮПАК: 2-[(2RS)-2-(1-хлорциклопропил)-3-(2-хлорфенил)-2-оксипропил]-2Н-1,2,4-триазол-3(4Н)-тион.

Структурная формула (не приводится).

Основной метаболит протиоконазола: протиоконазол-дестио (SXX 0665)

альфа-(1-хлорциклопропил)-альфа-(2-хлорфенил)метил-1Н-1,2,4-триазол-1-этанол (С.А.)

Структурная формула (не приводится).

Область применения препарата

Протиоконазол - фунгицид системного действия из группы ингибиторов синтеза эргостерина. Вещество обладает защитным, искореняющим и лечебным действием. При обработке вегетирующих растений оно эффективно подавляет развитие возбудителей ржавчины, мучнистой росы, септориоза, фузариоза колоса, ломкости стеблей и пятнистостей листьев на посевах ячменя, пшеницы и других культур, а при протравливании семян защищает последние от заражения твердой и пыльной головней и фузариозной корневой гнилью.

Применяется в России в качестве фунгицида системного действия в составе смесевых препаратов для протравливания зерна колосовых культур и обработки вегетирующих растений зерновых злаков и рапса с нормой расхода (37 - 50) г д.в./т семян или (80 - 100) г д.в./га.

Протиоконазол весьма лабильное вещество и при поступлении в растение очень быстро метаболизируется до более устойчивого соединения - протиоконазол-дестио (альфа-(1-хлорциклопропил)-альфа-(2-хлорфенил)метил-1Н-1,2,4-1-этанол). В связи с этим разработан метод, позволяющий осуществлять контроль за содержанием остаточных количеств протиоконазола в зеленой массе растений, семенах и масле рапса по протиоконазол-дестио.

При соблюдении всех регламентированных условий и проведении анализа в точном соответствии с данной методикой значение погрешности (и ее составляющих) результатов измерений не превышает значений, приведенных в табл. 1.

Метод основан на экстракции метоболита протиоконазол-дестио из зеленой массы водным раствором ацетона, из семян и масла ацетонитрилом, очистке экстрактов, содержащих коэкстрактивные компоненты, перераспределением в системе несмешивающихся растворителей, а также на колонке с оксидом алюминия с последующим измерением содержания протиоконазол-дестио в очищенных экстрактах методом капиллярной газожидкостной хроматографии (ГЖХ) при программировании температуры с термоионным детектором (ТИД) и обработкой хроматограмм методом абсолютной градуировки.

В предлагаемых условиях анализа метод специфичен.

Примечание. Допускается применение других средств измерений, вспомогательных устройств, реактивов и материалов с техническими и метрологическими характеристиками не хуже приведенных в разделе 4.

5.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работы с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.007-76, ГОСТ 12.1.005-88.

5.2. При проведении анализов горючих и вредных веществ соблюдают требования противопожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и должны быть в наличии средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-90.

5.3. При выполнении измерений с использованием хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцией по эксплуатации прибора.

5.4. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07.

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя с опытом работы на газовом хроматографе.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией "лаборант", имеющего опыт работы в химической лаборатории.

7.1. При выполнении измерений соблюдают следующие условия.

Условия приготовления растворов и подготовки проб к анализу:

- температура воздуха (20 +/- 5) °C;

- атмосферное давление (84 - 106) кПа;

- относительная влажность воздуха не более 80%.

7.2. Условия хроматографического анализа:

Температура термостата испарителя 260 °C.

Температура детектора 300 °C.

Режим программирования температуры колонки

Начальная температура 150 °C (2 мин.), скорость подъема температуры до 230 °C (0 мин.) 20 °C/мин.;

от 230 °C до 240 °C (4 мин.) скорость подъема температуры 3 °C/мин.;

от 240 °C до 270 °C (20 - 30 мин.) скорость подъема температуры 20 °C/мин.

Расход газов:

газа-носителя (гелий, азот) 2,2 куб. см/мин.;

водорода к ТИД 12,2 куб. см/мин.;

воздуха к ТИД 200 куб. см/мин.

Деление потока 1:1.

Объем вводимой пробы 1 куб. мм.

Время удерживания протиоконазол-дестио 7 мин. 20 с +/- 0,2 мин.

Линейный диапазон детектирования 0,1 - 2,0 нг.

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, градуировка хроматографа, подготовка колонки с оксидом алюминия.

8.1.1. Очистка н-гексана

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до прекращения окрашивания последней в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над поташом.

8.1.2. Очистка этилацетата

Приготовление раствора натрия углекислого с массовой долей 5%

Навеску (5 +/- 0,1) г натрия углекислого в конической колбе растворяют в 40 - 60 куб. см дистиллированной воды. Полученный раствор переносят в мерную колбу вместимостью 100 куб. см и доводят объем раствора до метки дистиллированной водой.

Срок хранения раствора 1 неделя.

Этилацетат промывают последовательно раствором натрия углекислого с массовой долей 5%, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над безводным карбонатом калия и перегоняют.

8.1.3. Очистка ацетона

Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 8 - 10 мм уплотняют тампоном из стекловаты, медленно выливают в колонку (при открытом кране) суспензию 5 г оксида алюминия нейтрального III степени активности в 15 куб. см гексана (оксид алюминия III степени активности по Брокману получают добавлением 6% воды к навеске оксида алюминия фирмы "Мерк" (Германия) I степени активности). Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку промывают 15 куб. см гексана со скоростью 1 - 2 капли в секунду, после чего она готова к работе.

При отработке методики или поступлении новой партии оксида алюминия проводят определение объема элюента, необходимого для полного вымывания протиоконазол-дестио из колонки с оксидом алюминия.

Готовят раствор гексан-этилацетат (85:15, по объему). Для этого в мерную колбу вместимостью 500 куб. см вносят 75 куб. см этилацетата и доводят объем раствора до метки гексаном. Срок хранения раствора 1 неделя.

Готовят раствор гексан-этилацетат (7:3, по объему). Для этого в мерную колбу вместимостью 500 куб. см носят 150 куб. см этилацетата и доводят объем раствора до метки гексаном. Срок хранения раствора 1 неделя.

В круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 0,1 куб. см градуировочного раствора протиоконазол-дестио с массовой концентрацией 10 мкг/куб. см в этилацетате (8.5.2) и отдувают растворитель током теплого воздуха. Остаток растворяют в 3 куб. см смеси гексан-этилацетат (85:15, по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на колонку с оксидом алюминия, подготовленную по 8.2. Промывают колонку 30 куб. см смеси гексан-этилацетат (85:15, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в секунду, элюат отбрасывают. Затем колонку промывают 40 куб. см смеси гексан-этилацетат (7:3, по объему), отбирая последовательно по 10 куб. см элюата. Каждую фракцию упаривают, остатки растворяют в 1 куб. см этилацетата, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., а затем хроматографируют. Условия хроматографирования в соответствии с 7.2.

По результатам обнаружения протиоконазол-дестио в каждой из фракций определяют объем элюента, необходимого для полного вымывания протиоконазол-дестио из колонки.

Капиллярную кварцевую колонку ZB-1 (типа SE-30) устанавливают в термостат хроматографа и, не подсоединяя к детектору, кондиционируют при температуре 280 °C и скорости газа-носителя 2 куб. см/мин. в течение 8 - 10 часов.

8.5.1. Исходный градуировочный раствор протиоконазол-дестио с массовой концентрацией 100 мкг/куб. см

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают (0,010 +/- 0,0001) г протиоконазол-дестио, растворяют в 40 - 50 куб. см этилацетата, доводят этим же растворителем до метки, тщательно перемешивают.

Раствор хранят в морозильной камере при температуре не выше (-18) °C в течение 3-х месяцев.

8.5.2. Градуировочный раствор протиоконазол-дестио с массовой концентрацией 10 мкг/куб. см (раствор N 1)

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 10 куб. см исходного градуировочного раствора протиоконазол-дестио с массовой концентрацией 100,0 мкг/куб. см (8.5.1), разбавляют этилацетатом и доводят объем до метки. Этот раствор используют для приготовления градуировочных растворов N 2 - 5.

Градуировочный раствор N 1 хранят в морозильной камере при температуре не выше (-18) °C в течение месяца.

8.5.3. Градуировочные растворы протиоконазол-дестио с массовой концентрацией 0,1 - 1,0 мкг/куб. см (растворы N 2 - 5)

В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают 1,0, 2,0, 5,0 и 10,0 куб. см градуировочного раствора протиоконазол-дестио с массовой концентрацией 10 мкг/куб. см (8.5.2), доводят объем раствора до метки этилацетатом, тщательно перемешивают, получают градуировочные растворы N 2 - 5 с массовой концентрацией протиоконазол-дестио 0,1, 0,2, 0,5 и 1,0 мкг/куб. см, соответственно.

Растворы готовят непосредственно перед использованием.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (мВ x с) от массовой концентрации протиоконазол-дестио в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной градуировки по 4 градуировочным растворам.

В инжектор хроматографа вводят по 1 куб. мм каждого градуировочного раствора (8.5.3) и анализируют при условиях хроматографирования по 7.2. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений. Расхождение между параллельными определениями не должно превышать предел повторяемости r.

Контроль стабильности градуировки проводят не реже 1 раза в три месяца, а также при смене реактивов или изменении условий анализа.

Для контроля стабильности используют вновь приготовленные градуировочные растворы с массовой концентрацией исследуемого вещества в начале, середине и в конце диапазона измерений, которые анализируют в точном соответствии с методикой.

Градуировочную характеристику считают стабильной, если для каждого контрольного образца выполняется условие (1)

Если условие стабильности не выполняется только для одного образца, то повторно анализируют этот образец для исключения результата, содержащего грубую ошибку.

Если градуировка нестабильна, выясняют причины нестабильности и повторяют контроль стабильности с использованием других образцов для градуировки, предусмотренных методикой. При повторном обнаружении нестабильности градуировки прибор градуируют заново.

Отбор проб производят в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79) и правилами, определенными ГОСТ 10852-86 "Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб" и ГОСТ 8988-77 "Масло рапсовое. ТУ".

Пробы зеленой массы хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике не более одного дня; для длительного хранения пробы замораживают и хранят при температуре -18 °C до анализа. Пробы семян высушивают до влажности (в соответствии ГОСТ 10852-86) и хранят в бумажных или тканевых мешочках в сухом, хорошо проветриваемом шкафу. Пробы масла хранят в плотно закрытой стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике при температуре не выше 4 °C. В некоторых случаях масло получают из семян рапса экстракцией органическими неполярными растворителями (петролейный и диэтиловый эфиры) непосредственно перед проведением анализа.

9.1.1. Экстракция протиоконазол-дестио из зеленой массы

Приготовление водного раствора ацетона (8:2, по объему)

В мерную колбу вместимостью 500 куб. см помещают 400 куб. см ацетона и доводят объем раствора в колбе до метки дистиллированной водой.

Срок хранения раствора 1 неделя.

Образец измельченного растительного материала массой 20 г помещают в стакан гомогенизатора вместимостью 500 куб. см, добавляют 100 куб. см смеси ацетон-вода (8:2, по объему) и гомогенизируют 3 мин. при 10000 об./мин. Гомогенат фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу вместимостью 250 куб. см. Осадок на фильтре промывают 50 куб. см смеси ацетон-вода (8:2, по объему). Экстракт и промывную жидкость переносят в химический стакан, перемешивают, измеряют объем раствора и 1/4 его часть (эквивалентную 5 г образца) переносят в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. Далее проводят очистку экстракта по 9.2.

9.1.2. Экстракция протиоконазол-дестио из семян

Образец размолотых семян массой 10 г помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 куб. см, добавляют 50 куб. см ацетонитрила и помещают на аппарат для встряхивания на 1 ч. Суспензию фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу вместимостью 250 куб. см. Осадок на фильтре промывают 25 куб. см ацетонитрила. Экстракт и промывную жидкость переносят в химический стакан, перемешивают, измеряют объем раствора и 1/2 его часть (эквивалентную 5 г образца) переносят в делительную воронку вместимостью 100 куб. см. В воронку вносят 10 куб. см гексана, насыщенного ацетонитрилом, интенсивно встряхивают в течение 2-х минут. После расслоения фаз гексановый слой отбрасывают, а ацетонитрильную фракцию переносят в круглодонную колбу, куда приливают 20 куб. см деионизованной воды. Дальнейшую очистку экстракта проводят по 9.2.

9.1.3. Экстракция протиоконазол-дестио из масла

К образцу масла массой 5 г, помещенного в плоскодонную колбу вместимостью 250 куб. см, приливают 10 куб. см гексана и перемешивают. К раствору добавляют 50 куб. см ацетонитрила и колбу помещают на встряхиватель на 30 мин. Верхний ацетонитрильный слой декантируют в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см через слой ваты, помещенной в конусную воронку. К оставшемуся в колбе маслу приливают 30 куб. см ацетонитрила и операцию экстракции повторяют. После декантации ацетонитрильного слоя вату промывают 10 куб. см ацетонитрила, которые объединяют с фильтратом. Объединенную ацетонитрильную фазу переносят в делительную воронку вместимостью 250 куб. см, добавляют 10 куб. см гексана, насыщенного ацетонитрилом, интенсивно встряхивают в течение 2-х минут. После расслоения фаз гексановый слой отбрасывают, а ацетонитрильную фракцию фильтруют через слой ваты, помещенный в конусную воронку, в круглодонную колбу. Содержимое колбы упаривают до маслянистого остатка на ротационном вакуумном испарителе при температуре 40 °C. Далее проводят очистку экстракта по 9.3.

Отобранные аликвоты экстрактов зеленой массы и семян, полученные по 9.1.1 и 9.1.2 и помещенные в круглодонные колбы, упаривают на ротационном вакуумном испарителе до водного остатка (4 - 6 куб. см) при температуре не выше 40 °C. К водному остатку добавляют 20 куб. см деионизованной воды, перемешивают и переносят в делительную воронку вместимостью 100 куб. см. В воронку вносят 30 куб. см хлористого метилена, интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После разделения фаз нижний органический слой фильтруют через слой безводного сульфата натрия в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. Операцию экстракции водной фазы повторяют еще дважды, используя 30 и 20 куб. см хлористого метилена. Объединенную органическую фазу, пропущенную через слой сульфата натрия, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре 30 °C и подвергают дополнительной очистке на колонке с оксидом алюминия по 9.3.

Остаток в круглодонной колбе, полученный по 9.1.3 и 9.2, растворяют в 2 куб. см смеси гексан-этилацетат (85:15, по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на колонку, подготовленную по 8.2. Колбу обмывают 2 куб. см смеси гексан-этилацетат (85:15, по объему), которые также наносят на колонку. Промывают колонку 20 куб. см смеси гексан-этилацетат (85:15, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в секунду, элюат отбрасывают. Протиоконазол-дестио элюируют с колонки 15 куб. см смеси гексан-этилацетат (7:3, по объему) при анализе экстракта масла и 25 куб. см этой же смеси при анализе экстрактов семян и зеленой массы, собирая элюат непосредственно в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. Раствор упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре 40 °C. Остаток экстракта зеленой массы растворяют в 2,5 куб. см, а семян и масла - в 1 куб. см этилацетата, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., и анализируют растворы на содержание протиоконазол-дестио. Условия хроматографирования по 7.2.

Полнота извлечения протиоконазол-дестио при проведении всех операций подготовки пробы не менее 82%.

10.1. В испаритель хроматографа вводят 1 куб. мм очищенного экстракта анализируемой пробы (9.1 - 9.3), анализируют при условиях 7.2 и регистрируют хроматограмму. Каждый экстракт хроматографируют дважды.

10.2. Для каждого образца повторяют операции по (9.1 - 9.3), 10.1.

11.1. Для обработки результатов хроматографического анализа используют программу сбора и обработки хроматографической информации "Хроматэк Аналитик", версия 1.20.

Альтернативная обработка результатов

При расчете содержания протиоконазол-дестио в эквивалентах протиоконазола полученное значение X умножают на 1,1.

11.2. За результат измерений принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, если выполняется условие приемлемости (3):

Если условие (3) не выполняется, выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и повторяют выполнение измерений в соответствии с требованиями МВИ.

11.3. Результат анализа в документах, предусматривающих его использование, представляют в виде:

В случае, если полученный результат измерений ниже нижней (выше верхней) границы диапазона измерений, то производят следующую запись в журнале:

Экстракты, при хроматографировании которых получают аналитический сигнал протиоконазол-дестио, превышающий аналитический сигнал, получаемый при хроматографировании градуировочного раствора с массовой концентрацией 1,0 мкг/куб. см, разбавляют этилацетатом, но не более чем в 10 раз, и анализируют в соответствии с данной методикой. При расчете содержания протиоконазол-дестио учитывают разбавление.

12.1. Проверку приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости проводят:

а) при возникновении спорных ситуаций между двумя лабораториями;

б) при проверке совместимости результатов измерений, полученных при сличительных испытаниях (при проведении аккредитации лабораторий и инспекционного контроля).

12.2. Для проведения проверки приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости каждая лаборатория использует пробы, оставленные на хранение.

Если критическая разность не превышена, то приемлемы оба результата измерений, проводимых двумя лабораториями, и в качестве окончательного результата используют их среднеарифметическое значение. Если критическая разность превышена, то выполняют процедуры, изложенные в ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 (5.3.3).

При разногласиях руководствуются ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 (5.3.4).

Контроль качества результатов измерений в лаборатории при реализации методики осуществляют по ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002, используя контроль стабильности среднеквадратического (стандартного) отклонения повторяемости по 6.2.2 ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 и показателя правильности по 6.2.4 ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002. Проверку стабильности осуществляют с применением контрольных карт Шухарта.

Периодичность контроля стабильности результатов выполнения измерений регламентируют в Руководстве по качеству лаборатории.

Рекомендуется устанавливать контролируемый период так, чтобы количество результатов контрольных измерений было от 20 до 30.

При неудовлетворительных результатах контроля, например при превышении предела действия или регулярном превышении предела предупреждения, выясняют причины этих отклонений, в том числе проводят смену реактивов, проверяют работу оператора.

ГНУ ВНИИ фитопатологии.