"МУК 4.1.2921-11. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методика измерений остаточного содержания клотианидина в зерне и соломе зерновых колосовых культур методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 12.07.2011)

1. Разработаны Всероссийским научно-исследовательским институтом фитопатологии.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 02.06.2011 N 1).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 12 июля 2011 г.

4. Введены в действие с момента утверждения.

5. Введены впервые.

Клотианидин - инсектицид нервно-паралитического действия, обладает широким спектром активности против сосущих, грызущих и почвенных насекомых на овощных культурах, фруктовых и цитрусовых деревьях, рисе, кукурузе и рапсе. Вещество обладает системной активностью и может использоваться как в качестве протравителя, так и для обработки почвы и надземных органов растений.

Применяется в России в качестве инсектицида для предпосевного протравливания зерна злаковых культур при норме расхода 375 г д.в./т семян, а также в качестве составного компонента комбинированных протравителей.

Свидетельство о метрологической аттестации от 11.01.2011 N 01.00225/2-11.

Настоящий документ устанавливает процедуру измерений массовой доли клотианидина в зерне в диапазоне 0,02 - 0,20 мг/кг, в соломе в диапазоне 0,05 - 0,50 мг/кг методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Название вещества по ИСО: Клотианидин.

Название вещества по ИЮПАК: (Е)-1-(2-хлор-1,3-тиазол-5-илметил)-3-метил-2-нитрогуанидин.

Структурная формула (не приводится).

При соблюдении всех регламентированных условий и проведении анализа в точном соответствии с данной методикой значение погрешности (и ее составляющих) результатов измерений не превышает значений, приведенных в табл. 1.

Метод основан на экстракции клотианидина из зерна и соломы пшеницы водным ацетоном, очистке экстрактов, содержащих клотианидин, от коэкстрактивных компонентов перераспределением их в системе несмешивающихся растворителей, а также на колонке с флоризилом, с последующим измерением содержания клотианидина в очищенных экстрактах на жидкостном хроматографе с ультрафиолетовым детектированием и обработкой хроматограмм методом абсолютной градуировки.

В предлагаемых условиях анализа метод специфичен.

Допускается применение других средств измерений, вспомогательных устройств, реактивов и материалов с техническими и метрологическими характеристиками, аналогичными приведенным в разделе 4.

5.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работы с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.007-76, 12.1.005-88.

5.2. При проведении анализов горючих и вредных веществ соблюдают требования противопожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91, и должны быть в наличии средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-90.

5.3. При выполнении измерений с использованием хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцией по эксплуатации прибора.

5.4. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07.

К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются специалисты, имеющие высшее или специальное химическое образование, опыт работы в химической лаборатории, прошедшие обучение и владеющие техникой проведения анализа, освоившие метод анализа в процессе тренировки и уложившиеся в нормативы контроля при проведении процедуры контроля погрешности анализа.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия.

7.1. Условия приготовления растворов и подготовки проб к анализу:

- температура воздуха (20 +/- 5) °C;

- атмосферное давление (84 - 106) кПа;

- относительная влажность воздуха не более 80%.

7.2. Условия хроматографического анализа

Температура колонки: 27 °C.

Подвижная фаза: ацетонитрил-вода (с объемным соотношением компонентов 20:80).

Скорость потока элюента: 0,8 куб. см/мин.

Рабочая длина волны: 270 нм.

Чувствительность: 0,00075 ед. абсорбции на шкалу.

Объем вводимой пробы: 5 куб. мм.

Время удерживания клотианидина: (8,0 +/- 0,2) мин.

Линейный диапазон детектирования: 0,1 - 1,0 нг.

Измерениям предшествуют следующие операции: приготовление растворов, приготовление подвижной фазы для ВЭЖХ, подготовка колонки с флоризилом, кондиционирование хроматографической колонки, градуировка хроматографа.

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 200 куб. см ацетонитрила, 800 куб. см бидистиллированной воды, перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр.

Срок хранения - 1 неделя.

Хроматографическую колонку Symmetry C18 устанавливают в термостат хроматографа и стабилизируют при температуре 27 °C и скорости потока подвижной фазой 0,8 куб. см/мин. не менее часа до установления стабильной базовой линии.

В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 10 мм помещают тампон из стекловаты и затем в нее всыпают 10 г сухого флоризила. Колонку промывают 30 куб. см этилацетата со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1 см, через колонку пропускают 15 куб. см этилацетата со скоростью 1 - 2 капли в секунду, после чего колонка готова к работе.

При отработке методики или поступлении новой партии флоризила проводят определение объема элюента, необходимого для полного вымывания клотианидина из колонки с флоризилом.

В круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 0,1 куб. см градуировочного раствора N 1 клотианидина с концентрацией 10 мкг/куб. см в ацетонитриле (п. 8.6.2), раствор упаривают досуха, остаток растворяют в 2 куб. см этилацетата, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на колонку с флоризилом, подготовленную по п. 8.4.

Колбу обмывают 3 куб. см этилацетата, которые также вносят в колонку. Промывают колонку 50 куб. см этилацетата со скоростью 1 - 2 капли в секунду, элюат отбрасывают. Затем через колонку пропускают 50 куб. см смеси этилацетат-ацетонитрил (1:1, по объему), отбирая последовательно по 5 куб. см элюата. Каждую фракцию упаривают, остатки растворяют в 1 куб. см ацетонитрила, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., вносят 2 куб. см подвижной фазы, подготовленной по п. 8.2, перемешивают и хроматографируют в соответствии с условиями п. 7.2.

По результатам обнаружения клотианидина в каждой из фракций определяют объем смеси этилацетат-ацетонитрил (1:1, по объему), необходимый для полного вымывания клотианидина из колонки.

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают (0,010 +/- 0,0002) г клотианидина, растворяют в 40 - 50 куб. см ацетонитрила, доводят ацетонитрилом до метки, тщательно перемешивают.

Раствор хранят в морозильной камере при температуре не выше минус 18 °C. Срок хранения - не более 3 месяцев.

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 10 куб. см исходного раствора клотианидина с массовой концентрацией 100 мкг/куб. см п. 8.6.1), разбавляют ацетонитрилом до метки. Этот раствор используют для приготовления градуировочных растворов N 2 - 5.

Градуировочный раствор N 1 хранят в морозильной камере при температуре не выше минус 18 °C. Срок хранения - не более 1 месяца.

В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают 0,2; 0,4; 1,0 и 2,0 куб. см градуировочного раствора N 1 клотианидина с массовой концентрацией 10 мкг/куб. см, доводят до метки подвижной фазой, приготовленной по п. 8.2, тщательно перемешивают. Получают растворы с массовой концентрацией клотианидина 0,02; 0,04; 0,1 и 0,2 мкг/куб. см. соответственно.

Растворы готовят непосредственно перед использованием.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (мкВ x с) от концентрации клотианидина в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки.

В инжектор хроматографа вводят по 5 куб. мм каждого градуировочного раствора (п. 8.6.3) и анализируют при условиях п. 7.2. Осуществляют не менее 3 параллельных определений. Расхождение между параллельными определениями не должно превышать предела повторяемости r.

По полученным данным строят градуировочную характеристику.

Контроль стабильности градуировки проводят не реже 1 раза в три месяца, а также при смене реактивов или изменении условий анализа.

Для контроля стабильности используют вновь приготовленные градуировочные растворы с массовой концентрацией исследуемого вещества в начале, середине и в конце диапазона измерений, которые анализируют в точном соответствии с методикой.

Градуировочную характеристику считают стабильной, если для каждого контрольного образца выполняется условие:

Если условие стабильности не выполняется только для одного образца, то повторно анализируют этот образец для исключения результата, содержащего грубую ошибку.

Если градуировка нестабильна, выясняют причины нестабильности и повторяют контроль стабильности с использованием других образцов для градуировки, предусмотренных методикой. При повторном обнаружении нестабильности градуировки прибор градуируют заново.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (от 21.08.79 N 2051-79) и правилами, определенными ГОСТ 13586.3-83 "Зерно. Правила приемки и методы отбора проб", Р 50436-92 "Зерновые. Отбор проб зерна", 27262-87 "Корма растительного происхождения. Методы отбора проб".

Пробы зерна и соломы высушивают до стандартной влажности (в соответствии с ГОСТ 10852-86) и хранят в бумажных или тканевых мешочках в сухом, хорошо проветриваемом шкафу, недоступном для грызунов.

9.1.1. Зерно. Образец размолотого зерна массой 10 г помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 куб. см, добавляют 100 куб. см смеси ацетон-вода (3:1, по объему), перемешивают и колбу помещают на встряхиватель на 40 мин. Суспензию фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу Бунзена вместимостью 250 куб. см. Остаток на фильтре промывают 50 куб. см приведенной выше смеси. Экстракт и промывную жидкость переносят в химический стакан, перемешивают, измеряют объем раствора и 1/2 его часть, эквивалентную 5 г образца, переносят в круглодонную колбу вместимостью 250 куб. см. Дальнейшую очистку экстракта проводят по п. 9.2.

9.1.2. Солома. Образец измельченного растительного материала массой 5 г помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 куб. см, добавляют 100 куб. см смеси ацетон-вода (3:1, по объему), перемешивают и колбу помещают на встряхиватель на 40 мин. Суспензию фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу Бунзена вместимостью 250 куб. см. Остаток на фильтре промывают 50 куб. см приведенной выше смеси. Экстракт и промывную жидкость переносят в круглодонную колбу вместимостью 250 куб. см. Дальнейшую очистку экстракта проводят по п. 9.2.

Отобранные аликвоты экстрактов растительного материала, полученные по пп. 9.1.1 и 9.1.2 и помещенные в круглодонные колбы, упаривают на ротационном вакуумном испарителе до водного остатка объемом 3 - 5 куб. см при температуре не выше 40 °C. К водному остатку приливают 20 куб. см деионизованной воды, перемешивают и переносят в делительную воронку вместимостью 100 куб. см. В воронку вносят 30 куб. см хлористого метилена, интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После разделения фаз нижний органический слой собирают в делительную воронку вместимостью 250 куб. см, а водную фазу экстрагируют еще дважды, используя по 30 куб. см хлористого метилена. К объединенной дихлорметановой фракции в делительной воронке приливают 25 куб. см водного раствора углекислого калия с молярной концентрацией 0,05 моль/куб. дм, содержимое интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После разделения фаз нижний органический слой, содержащий клотианидин, фильтруют через слой безводного сульфата натрия в круглодонную колбу и затем упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C. Дальнейшую очистку экстракта проводят по п. 9.3.

Сухой остаток экстрактов зерна и соломы, полученный по п. 9.2, растворяют в 2 куб. см этилацетата, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на колонку, подготовленную по п. 8.4. Колбу обмывают 3 куб. см этилацетата, который также наносят на колонку. Колонку промывают 40 куб. см этилацетата со скоростью 1 - 2 капли в секунду, элюат отбрасывают. Клотианидин элюируют из колонки 25 куб. см смеси этилацетат-ацетонитрил (1:1, по объему) непосредственно в грушевидную колбу. Раствор упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °C. Сухой остаток экстракта зерна растворяют в 5 куб. см, а соломы - в 12,5 куб. см подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 8.2), раствор помещают в ультразвуковую ванну на 1 мин. и анализируют на содержание клотианидина по п. 10.

Полнота извлечения клотианидина при проведении всех операций подготовки пробы не менее 82%.

10.1. В инжектор хроматографа вводят 5 куб. мм очищенного экстракта анализируемой пробы (пп. 9.1 - 9.3), анализируют при условиях (п. 7.2) и регистрируют хроматограмму. Каждый экстракт хроматографируют дважды.

10.2. Для каждого образца повторяют операции по пп. 9.1 - 9.3, 10.1.

11.1. Для обработки результатов хроматографического анализа используют программное обеспечение "Breeze".

Альтернативная обработка результатов.

По градуировочной характеристике находят значение массовой концентрации клотианидина в экстрактах, C, мкг/куб. см. Массовую долю клотианидина X, (мг/кг) в образцах зерна и соломы рассчитывают по формуле (2):

11.2. За результат измерений принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, если выполняется условие приемлемости (3):

Если условие (3) не выполняется, выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и повторяют выполнение измерений в соответствии с требованиями МВИ.

11.3. Результат анализа в документах, предусматривающих его использование, представляют в виде:

В случае если полученный результат измерений ниже нижней (выше верхней) границы диапазона измерений, то производят следующую запись в журнале:

"массовая доля клотианидина в зерне менее 0,02 мг/кг (более 0,20 мг/кг)";

"массовая доля клотианидина в соломе менее 0,05 мг/кг (более 0,50 мг/кг)".

Экстракты, при хроматографировании которых получают аналитический сигнал клотианидина, превышающий аналитический сигнал, получаемый при хроматографировании градуировочного раствора с массовой концентрацией 0,2 мкг/куб. см, разбавляют и анализируют в соответствии с данной методикой.

12.1. Проверку приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости проводят:

а) при возникновении спорных ситуаций между двумя лабораториями;

б) при проверке совместимости результатов измерений, полученных при сличительных испытаниях (при проведении аккредитации лабораторий и инспекционного контроля).

12.2. Для проведения проверки приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости каждая лаборатория использует пробы, оставленные на хранение.

Если критическая разность не превышена, то приемлемы оба результата измерений, проводимых двумя лабораториями, и в качестве окончательного результата используют их среднеарифметическое значение. Если критическая разность превышена, то выполняют процедуры, изложенные в ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 (5.3.3).

При разногласиях руководствуются ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 (5.3.4).

Контроль качества результатов измерений в лаборатории при реализации методики осуществляют по ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 ("Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений"), используя контроль стабильности среднеквадратического (стандартного) отклонения повторяемости по п. 6.2.2 ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 и показателя правильности по п. 6.2.4 ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002. Проверку стабильности осуществляют с применением контрольных карт Шухарта.

Периодичность контроля стабильности результатов выполнения измерений регламентируют в Руководстве по качеству лаборатории.

Рекомендуется устанавливать контролируемый период так, чтобы количество результатов контрольных измерений было от 20 до 30.

При неудовлетворительных результатах контроля, например при превышении предела действия или регулярном превышении предела предупреждения, выясняют причины этих отклонений, в том числе проводят смену реактивов, проверяют работу оператора.

Разработаны Всероссийским научно-исследовательским институтом фитопатологии.