"ГОСТ Р 53514-2009. Национальный стандарт Российской Федерации. Мясо и мясные продукты. Иммунопреципитационный метод определения массовой доли животного (говяжьего, свиного, бараньего) белка"
(утв. и введен в действие Приказом Ростехрегулирования от 11.12.2009 N 748-ст)

Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. N 184-ФЗ "О техническом регулировании", а правила применения национальных стандартов Российской Федерации - ГОСТ Р 1.0-2004 "Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения".

1. Разработан Государственным научным учреждением Всероссийским научно-исследовательским институтом мясной промышленности им. В.М. Горбатова Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИМП им. В.М. Горбатова Россельхозакадемии).

2. Внесен Техническим комитетом по стандартизации ТК 226 "Мясо и мясная продукция".

3. Утвержден и введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 11 декабря 2009 г. N 748-ст.

4. Введен впервые.

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячно издаваемых информационных указателях "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет.

Настоящий стандарт распространяется на мясо и мясные полуфабрикаты и устанавливает иммунопреципитационный метод определения массовой доли животного (говяжьего, свиного, бараньего) белка.

Стандарт предназначен для идентификации свиного, говяжьего или бараньего белков в составе мясного сырья и мясных продуктов, не подвергнутых тепловой обработке.

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ Р 50444-92 Приборы, аппараты и оборудование медицинские. Общие технические условия

ГОСТ Р 51447-99 (ИСО 3100-1-91) Мясо и мясные продукты. Методы отбора проб

ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.019-79 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

ГОСТ 12.4.009-83 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание

ГОСТ 1770-74 Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 9656-75 Реактивы. Кислота борная. Технические условия

ГОСТ 10652-73 Реактивы. Соль динатриевая этилендиамин-N, N, N', N'-тетрауксусной кислоты 2-водная (трилон Б). Технические условия

ГОСТ 20903-75 Кюветы прямоугольные кварцевые для спектрофотометров. Основные размеры. Технические требования

ГОСТ 25011-81 Мясо и мясные продукты. Методы определения белка

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26678-85 Холодильники и морозильники бытовые электрические компрессионные параметрического ряда. Общие технические условия

Примечание. При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

Метод основан на проявлении особых свойств защитных систем высших позвоночных - вырабатывать новые сывороточные белки (антитела) при введении в организм посторонних для него веществ (антигенов). Используют диагностическую преципитирующую сыворотку к конкретному виду животного белка, вызывающую образование нерастворимого комплекса антиген-антитело.

4.1. Диапазон измерений массовой доли животного (говяжьего, свиного, бараньего) белка от 1% до 85%.

4.2. Метрологические характеристики метода при доверительной вероятности 0,95 приведены в таблице 1.

5.1. Отбор проб - по ГОСТ Р 51447.

5.2. Пробу хранят в холодильнике при температуре от 0 °C до 5 °C до полного завершения испытания в течение суток.

Допускается хранение проб при температуре от минус 20 °C до минус 10 °C в герметичной упаковке в течение одной недели с даты отбора проб на исследование.

Спектрофотометр СФ-103 типа "Аквилон", обеспечивающий измерения в диапазоне длин волн от 200 до 900 нм по [1].

Кюветы кварцевые толщиной 1 см по ГОСТ 20903.

Весы лабораторные с пределом допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания не более +/- 0,1 мг.

Микроизмельчитель тканей РТ-2 по [2] или гомогенизатор с частотой вращения 8000 - 24000 об/мин.

Центрифуга с регулируемой скоростью вращения до 8000 об/мин.

Пробирки центрифужные по ГОСТ 25336.

Аппарат встряхивающий.

Холодильник бытовой по ГОСТ 26678.

Дозатор пипеточный переменного объема по ГОСТ Р 50444 и [3].

Колбы мерные 2-го класса точности вместимостью 250 см3 по ГОСТ 1770.

Цилиндр мерный 2-го класса точности вместимостью 250 см3 по ГОСТ 1770.

Воронки стеклянные ВД-1-100 ХС по ГОСТ 25336.

Диагностическая сыворотка по [4].

Свинина, говядина, баранина с массовой долей белка по Кьельдалю не менее 18% по ГОСТ 25011 для использования в качестве контрольного образца.

Соевый изолят с массовой долей белка по Кьельдалю не менее 85% по ГОСТ 25011.

Кислота борная по ГОСТ 9656, ч.

2-амино-2(гидроксиметил)-1,3-пропандиол (ТРИС) с массовой долей основного вещества 99,9%.

Соль динатриевая этилендиамин-N, N, N', N'-тетрауксусной кислоты (трилон Б) по ГОСТ 10652, ч.д.а.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками, оборудования с техническими характеристиками и реактивов по качеству не ниже указанных в настоящем стандарте.

7.1. Приготовление растворов

7.1.1. Приготовление концентрированного буферного раствора

Навеску 2-амино-2(гидроксиметил)-1,3-пропандиола (ТРИС) массой 15,0 г и навеску трилона Б массой 1,5 г с помощью воронки переносят в мерную колбу вместимостью 250 см3 и при перемешивании добавляют 100 - 150 см3 дистиллированной воды. Полученный раствор перемешивают, в него добавляют постепенно 5,5 г борной кислоты и доводят объем раствора до метки дистиллированной водой. Раствор тщательно перемешивают до растворения осадка.

7.1.2. Приготовление рабочего буферного раствора

В мерную колбу вместимостью 250 см3 с помощью мерного цилиндра вносят 50 см3 концентрированного буферного раствора. Раствор в колбе доводят до метки дистиллированной водой, тщательно перемешивают и получают рабочий буферный раствор, содержащий в 1 см3 0,012 г ТРИС, 0,001 г трилона Б и 0,0044 г борной кислоты.

7.2. Приготовление испытуемого экстракта пробы

7.2.1. Навеску пробы массой 5,0 г перемешивают с 5 см3 рабочего буферного раствора в гомогенизаторе в течение 5 мин и выдерживают смесь 1 ч при температуре от 5 °C до 8 °C, периодически встряхивая в течение 5 мин.

7.2.2. Смесь центрифугируют при 5000 об/мин в течение 20 мин. Для измерений используют верхний прозрачный слой, содержащий экстракт анализируемого белка.

7.3. Приготовление двухкомпонентных модельных мясорастительных смесей для построения градуировочного графика

Навески по 25,0 г свинины (говядины или баранины) смешивают с навесками 400,0 г и 100,0 г соевого изолята и навески по 100,0 г свинины (говядины или баранины) смешивают с навесками 100, 30, 15 и 3,5 г соевого изолята.

Каждую смесь перемешивают на микроизмельчителе тканей в течение 30 мин до образования гомогенной массы. Допускается использование уменьшенных навесок в случае приготовления смеси путем растирания в ступке. Получают двухкомпонентные модельные мясорастительные смеси, массовая доля животного (говяжьего, свиного, бараньего) белка в которых относительно массовой доли общего белка равна 1,3%; 5,0%; 17,5%; 41,4%; 58,5% и 86,1%.

Предварительно определяют массовую долю общего белка методом Кьельдаля по ГОСТ 25011.

8.1. Измерение испытуемых растворов

8.1.1. 20 мм3 экстракта пробы смешивают с 400 мм3 рабочего буферного раствора, измеряют фоновое поглощение на спектрофотометре при (контроль), затем добавляют 20 мм3 диагностической сыворотки, содержащей антитела, к определяемому виду белка, проводят реакцию осаждения при постоянном встряхивании смеси в течение 1 ч. Для выявления специфического белка измеряют оптическую плотность среды в кювете с толщиной оптического слоя 1 см.

8.1.2. Для подтверждения действия диагностической преципитирующей сыворотки на животный белок параллельно проводят анализ контрольного образца, не содержащего определяемый белок.

8.1.3. Для каждого испытуемого раствора проводят два измерения, по результатам которых с помощью градуировочного графика находят средние значения массовой концентрации животного (говяжьего, свиного, бараньего) белка в этих растворах.

8.2. Построение градуировочного графика

Градуировочный график строят по результатам двукратного определения в соответствии с 8.1.1 массовой доли животного (говяжьего, свиного, бараньего) белка в двухкомпонентных модельных мясорастительных смесях, содержащих животный белок и добавки растительного соевого белка, соответственно в таблицах 2 - 4.

9.1. Массовую долю животного (говяжьего, свиного, бараньего) белка , относительно массовой доли общего белка, вычисляют по формуле

где C - среднеарифметическое значение массовой доли животного (говяжьего, свиного, бараньего) белка в испытуемой пробе, %;

- массовая доля общего белка в анализируемом образце, определенная методом Кьельдаля, %.

9.2. За окончательный результат измерения принимают среднеарифметическое из двух параллельных определений, если выполняется условие приемлемости:

где и - результаты параллельных определений массовой доли животного (говяжьего, свиного, бараньего) белка, определенные по градуировочному графику, %;

- предел повторяемости, приведенный в таблице 1.

Результат вычислений округляют до целого числа.

10.1. При подготовке и проведении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007.

10.2. Помещение, в котором проводят измерения, должно быть снабжено приточно-вытяжной вентиляцией. Работу необходимо проводить, соблюдая правила личной гигиены и противопожарной безопасности в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.004, и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009.

10.3. При работе с электроприборами необходимо соблюдать требования безопасности по ГОСТ 12.1.019.