"ГОСТ 25586-83 (СТ СЭВ 2700-80). Государственный стандарт Союза ССР. Птица сельскохозяйственная. Методы лабораторной диагностики болезни Марека"
(введен Постановлением Госстандарта СССР от 12.01.1983 N 96)
(ред. от 17.03.1988)

Настоящий стандарт распространяется на кур и устанавливает методы лабораторной диагностики болезни Марека.

Стандарт применяют при диагностировании заболевания птицы в лабораториях ветеринарных научно-исследовательских учреждений.

Стандарт полностью соответствует СТ СЭВ 2700-80.

1.1. Для патологоанатомических исследований отбирают тушки павшей или убитой птицы.

1.2. Для гистологических исследований от каждой павшей и убитой птицы отбирают пробы нервов Plexus brachialis и Truncus ischiadicus; пробы из органов с выраженными опухолевыми изменениями (печени, почек, яичника, железистого желудка, сердца, легких, поджелудочной железы).

Пробы должны быть не более 1x2x2 см. Отобранные пробы фиксируют в 10%-ном нейтральном растворе формалина и консервируют в герметически закрытых стеклянных или пластмассовых бутылках или упаковывают в фиксированном влажном виде без жидкости в запаянных пластмассовых пакетах.

1.3. Исключен с 01.07.1988. - Изменение N 1, утв. Постановлением Госстандарта СССР от 17.03.1988 N 597.

1.4. Для проведения серологических исследований пробы крови птиц в количестве 7 - 10 см³ берут стерильно из подкрыльцовой вены в пробирки, увлажненные физиологическим раствором. Кровь выдерживают при комнатной температуре до образования сгустка, затем осторожно обводят иглой или пастеровской пипеткой и оставляют на 2 - 3 ч, образовавшуюся сыворотку отсасывают пипеткой в стерильные пробирки.

1.5. Пробы упаковывают в коробку, запечатывают и доставляют в лабораторию.

В сопроводительном документе указывают время гибели или убоя птицы, ее возраст, а также эпизоотическую обстановку в хозяйстве.

2.1. Патологоанатомический метод

Сущность метода заключается в обнаружении специфических для болезни Марека (БМ) патологоанатомических изменений и их дифференциации от лимфоидного лейкоза (ЛЛ).

2.1.1. Проведение исследования

После подготовки проводят наружный осмотр тушки, отмечая поражения кожи. Затем кожу снимают и оценивают состояние скелетной мускулатуры (шеи, грудной мышцы, брюшка, поверхностей бедра). После этого птицу вскрывают и проводят оценку органов брюшной полости, включая фабрициеву бурсу, а также оценку основных стволов нервов в следующем порядке:

в области шеи - N. vagus и N. cervicalis, блуждающего нерва, проходящего в брыжейке между печенью и железистым желудком; Pl. coeliacus, расположенного в области A. coeliaca каудальной ветви N. intestinalis, а также Pl. ischiadicus, Pl. brachialis и Pl. lumbales.

2.1.2. Обработка результатов

Болезнь Марека диагносцируют при обнаружении:

изменений нервов в виде утолщений, утраты поперечной полосатости или узлового опухолевидного увеличения в объеме;

изменений глаз в виде деформации зрачка с изменением цвета радужной оболочки или без изменения ее (чаще всего при классической форме);

изменений кожи в виде множественных до величины с горошину опухолевидно утолщенных фолликулов перьев, а также диффузно опухолевидных утолщений кожи, частично с некрозами;

опухолей в органах в виде мелких множественных очажков, диффузного набухания или опухолевых узлов у птиц в возрасте 5 - 6 месяцев;

опухолей в сочетании с изменениями нервов, глаз или опухолевидными изменениями кожи.

При наличии опухолей в органах птиц старше 5 - 6-месячного возраста, не имеющих изменений нервов, глаз или кожи, болезнь Марека дифференцируют от лимфоидного лейкоза на основании:

различий в средней частоте появления опухолей в разных органах при заболевании болезнью Марека и лимфоидным лейкозом в соответствии с табл. 1;

--------------------------------

<*> Частота поражения органов может изменяться в зависимости от тяжести патологического процесса и проявления ассоциированной формы болезни Марека.

<**> Для бройлеров.

различий в патологоанатомической картине изменений органов при болезни Марека и лимфоидном лейкозе и наличия опухолей в фабрициевой бурсе при лимфоидном лейкозе в соответствии с табл. 2.

При лимфоидном лейкозе в отличие от болезни Марека в среднем до 60% случаев фабрициева бурса преимущественно поражается опухолевидными изменениями. Поэтому в практике диагностики при наличии опухолей фабрициевой бурсы у птиц, начиная с 6-месячного возраста, можно предварительно ставить диагноз - лимфоидный лейкоз.

Дифференциальную диагностику болезни Марека и лимфоидного лейкоза на основании данных патологоанатомических исследований с учетом возраста проводят в соответствии с табл. 3.

2.2. Гистологический метод

Сущность метода заключается в обнаружении специфических для болезни Марека патологогистологических изменений и их дифференциации от изменений при лимфоидном лейкозе.

2.2.1. Аппаратура, материалы, реактивы и растворы

Для проведения исследования применяют:

микротом замораживающий или парафиновый;

микроскоп;

стекла предметные по ГОСТ 9284-75;

стекла покровные по ГОСТ 6672-75;

парафин с точкой плавления 58 °C по ГОСТ 23683-79;

спирт этиловый или абсолютный по ГОСТ 5962-67;

метилбензоат;

бензол по ГОСТ 5955-75;

гематоксилин;

эозин;

спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962-67 или опал, 70%-ный раствор с 1%-ной соляной кислотой по ГОСТ 857-78;

ксилол по ГОСТ 9949-76;

ацетон по ГОСТ 2603-79;

карбол-ксилол;

бальзам для заливки по ГОСТ 2290-76.

2.2.2. Подготовка к исследованию

Из проб органов, фиксированных в формалине, готовят замороженные или парафиновые срезы, которые окрашивают гематоксилин-эозином или другими красителями и просматривают под микроскопом.

2.2.3. Обработка результатов

Результаты гистологических исследований оценивают в соответствии с табл. 4.

2.3. Исключен с 01.07.1988. - Изменение N 1, утв. Постановлением Госстандарта СССР от 17.03.1988 N 597.

2.3.1. Аппаратура и материалы

Для проведения исследования применяют:

термостат с температурой нагрева 37 - 38 °C;

мешалку магнитную;

пробирки стеклянные вместимостью 10, 15 и 20 см³ по ГОСТ 25336-82;

пипетки пастеровские или пипетки вместимостью 1, 2, 5 и 10 см³ по ГОСТ 20292-74;

колбы конические стеклянные вместимостью 50 и 100 см³ по ГОСТ 1770-74;

флаконы для культуры клеток вместимостью 50, 100, 200 и 500 см³ из нейтрального стекла;

раствор Хенкса;

трипсин, 0,25%-ный раствор;

среду N 199;

сыворотку телячью эмбриональную.

2.3.2. Проведение исследования

Из ткани почек только что убитой больной птицы вырезают кусочки размером 2 - 3 см³, которые отмывают раствором Хенкса и добавляют 0,25%-ный раствор трипсина в соотношении 1:10. Суспензию перемешивают на магнитной мешалке в течение 20 - 30 мин при комнатной температуре.

Клеточную суспензию затем фильтруют через два слоя марли и центрифугируют в течение 10 - 15 мин с частотой вращения 1000 мин^-1, готовят суспензию клеток в среде роста, содержащей в 1 см³ 800 тыс. клеток, высевают ее во флаконы и инкубируют при температуре 37 °C.

(в ред. Изменения N 1, утв. Постановлением Госстандарта СССР от 17.03.1988 N 597)

2.3.3. Исключен с 01.07.1988. - Изменение N 1, утв. Постановлением Госстандарта СССР от 17.03.1988 N 597.

2.4. Серологический метод

Сущность метода заключается в обнаружении антител к вирусу болезни Марека или антигена этого вируса в реакции преципитации в агаровом геле.

2.4.1. Аппаратура, реактивы и материалы

Для проведения исследования применяют:

термостат с температурой нагрева 37 - 38 °C;

чашки Петри по ГОСТ 25336-82;

стекла предметные по ГОСТ 9284-75;

натрия хлорид по ГОСТ 4233-77, 0,87%-ный раствор (физиологический раствор) с pH 7,2 - 7,4;

гель 1%-ного агара; готовят следующим образом: берут 10 г высококачественного очищенного агара, 80 г хлорида натрия и доводят дистиллированной водой до 1000 см³. Смесь автоклавируют при 1 атм в течение 30 мин, фильтруют через два слоя марли и доводят pH смеси при помощи 10%-ного раствора гидроокиси натрия до 7,2 - 7,4. Среду консервируют мертиолатом (0,01% к общему объему), разливают в колбы или стеклянные бутылки по 50 или 100 см³, охлаждают и хранят при температуре 2 - 4 °C. В этих условиях среду хранят до 14 суток;

специфический тест-антиген вируса болезни Марека с титром от 1:8 до 1:16;

специфическую преципитирующую тест-сыворотку к вирусу болезни Марека (например, от спонтанно заболевшей птицы) с титром от 1:8 до 1:16;

контрольный антиген отрицательный;

контрольную сыворотку отрицательную;

среду для выращивания клеток;

среду поддерживающую.

2.4.2. Подготовка к исследованию

Для исследования в реакции преципитации в агаровом геле из эпителий фолликулов перьев готовят суспензию следующим образом: с наружной поверхности бедра и крыльев убитой птицы выщипывают по 10 - 15 перьев. Образовательная ткань внутри фолликулов перьев обязательно должна быть сохранена. Фолликулы перьев с эпителиальными клетками используют для получения суспензии и из них готовят экстракт для серологического исследования (индикация антигена). Очины перьев измельчают на кусочки, которые затем растирают в гомогенизаторе или в ступке со стерильным песком или замораживают в жидком азоте. Затем их заливают физиологическим раствором в соотношении 1:10 и экстрагируют в течение 24 ч при 4 °C. Надосадочную жидкость экстракта исследуют в реакции преципитации.

2.4.3. Проведение исследования

Для постановки реакции преципитации агаровую среду расплавляют при температуре 60 - 65 °C, разливают в чашки Петри или наносят на предметные стекла, чтобы толщина слоя агара была не менее 2 мм.

В агаровой пластинке делают шесть лунок в виде шестиугольника и одну лунку в центре. Шесть лунок диаметром 4 мм должны располагаться по окружности на расстоянии 2 мм друг от друга и от края центральной лунки.

Во избежание подтекания антигена и сыворотки под агар дно лунок осторожно расплавляют или в каждую лунку вносят небольшое количество расплавленного агара. В двухслойном агаре лунки пробивают только в верхнем слое.

Для выявления специфических антител в сыворотке крови в центральную лунку вносят специфический вирусный антиген, а в периферические лунки - испытуемые сыворотки. Специфический антиген готовят из перьевых фолликулов птиц, экспериментально инфицированных вирусом болезни Марека.

Контролями служат:

специфический вирусный антиген + специфическая сыворотка;

специфический вирусный антиген + контрольная сыворотка (отрицательная);

специфический вирусный антиген + физиологический раствор.

Для выявления вирусного антигена в центральную лунку вносят специфическую сыворотку, а в периферические лунки испытуемый материал. При этом необходимо использовать экстракт из перьев фолликулов спонтанно заболевшей птицы или клеточную культуру, зараженную вирусом.

Контролями служат:

специфическая сыворотка + специфический вирусный антиген;

специфическая сыворотка + контрольный антиген (отрицательный).

После заполнения лунок компонентами закрытые чашки или предметные стекла помещают во влажную камеру или термостат при температуре 37 °C.

Результаты учитывают через 24 и 48 ч. Конечный учет проводят через 72 ч.

2.4.4. Обработка результатов

Реакцию на чашках Петри и предметных стеклах учитывают в косонаправленном пучке света на темном фоне. Сначала регистрируют контрольные линии преципитации, которые должны появляться между лунками со специфическим антигеном и специфической сывороткой. Пробы с линиями преципитации считают положительными.

Реакцию считают положительной при образовании линий преципитации между лунками с испытуемым материалом и специфическим антигеном или сывороткой при условии отсутствия линий преципитации с отрицательными антигенами и сывороткой.